靈菌紅素與太湖土著藻毒素降解菌協(xié)同控藻作用研究.pdf

1、我國(guó)水體富營(yíng)養(yǎng)化問題日趨嚴(yán)重，由此引發(fā)的有毒有害藻類水華及其分泌的藻毒素等嚴(yán)重威脅著人類和環(huán)境的安全。微生物防治具有成本低、效率高、不易產(chǎn)生二次污染和安全性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在藻和藻毒素的治理上更具有應(yīng)用前景。本論文首先探究靈菌紅素對(duì)銅綠微囊藻的作用特性和作用機(jī)制。其次成功分離出藻毒素降解純種菌株a7，并研究其降解藻毒素的途徑與機(jī)制。最后初步探索靈菌紅素-藻毒素降解菌和粘質(zhì)沙雷氏菌-藻毒素降解菌協(xié)同作用體系在抑制藻類和降解藻毒素上的綜合效果。<

2、br>　　一、靈菌紅素對(duì)銅綠微囊藻的作用及機(jī)制研究
　　培養(yǎng)銅綠微囊藻至對(duì)數(shù)期后染毒，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)合流式細(xì)胞儀分析不同劑量靈菌紅素對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)抑制作用。1.25、2.50、5.00μg/mL靈菌紅素染毒24h、48h，研究靈菌紅素對(duì)ROS、SOD、DNA含量以及細(xì)胞內(nèi)、外MCs的影響。靈菌紅素染毒15d，觀測(cè)藻密度及胞內(nèi)、外MCs的變化。結(jié)果顯示，靈菌紅素染毒24h對(duì)銅綠微囊藻的EC50為2.76μg/mL。不同濃度的靈菌紅

3、素染毒24h后銅綠微囊藻的直徑均明顯大于正常細(xì)胞，細(xì)胞DNA含量均明顯高于正常。2.50、5.00μg/mL靈菌紅素染毒24h后，ROS顯著升高，SOD顯著降低。染毒后的銅綠微囊藻細(xì)胞膜的完整性存在不同程度的受損。靈菌紅素抑制MC-LR的產(chǎn)生，2.50μg/mL時(shí)抑制效果最顯著。染毒時(shí)間增加后，靈菌紅素的抑制作用隨之增強(qiáng)，胞外MC-LR濃度也逐漸升高。綜上，靈菌紅素能誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷和增殖抑制，抑制銅綠微囊藻生長(zhǎng)。靈菌紅素短期抑制MC-

4、LR的產(chǎn)生，長(zhǎng)期作用后亦增加胞外MC-LR的釋放量。
　　二、太湖土著藻毒素降解菌的篩選及降解特性研究
　　篩選藻毒素降解菌群，并對(duì)其16S rDNA V4區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序，分析菌相構(gòu)成及變化。通過16S rDNA鑒定分離獲得的菌株a7。提取菌株a7的不同細(xì)胞物質(zhì)，判斷其降解物質(zhì)來源。PCR擴(kuò)增并測(cè)序菌株a7的mlr基因簇。通過HPLC和LC-TOF-MS分析MC-LR降解過程中的主要中間產(chǎn)物，初步探討降解途徑。結(jié)果顯示，藻

5、毒素的馴化培養(yǎng)中，具有藻毒素降解功能的細(xì)菌逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌種。藻毒素降解菌株a7對(duì)藻毒素粗提液和標(biāo)準(zhǔn)品中MC-LR的平均降解速率分別約為0.60μg/(mL·h)和3.33μg/(mL·h)。經(jīng)鑒定，菌株a7屬于鞘氨醇單胞菌屬（Sphingopyxis sp.）。菌株a7降解MC-LR的活性物質(zhì)位于胞內(nèi)，且不耐熱。PCR擴(kuò)增到mlrA、mlrC、mlrD基因。LC-TOF-MS檢測(cè)到615.3398([M+H]+)，315.1955([M

6、+H-NH3]+)和283.1700([M+H-NH3-MeOH]+)的中間產(chǎn)物質(zhì)子化離子。綜上，菌株a7含有mlrA、mlrC、mlrD同源基因，降解活性物質(zhì)可能是胞內(nèi)酶，降解產(chǎn)物中存有Tetrapeptide、Adda和其他離子碎片。
　　三、靈菌紅素與太湖土著藻毒素降解菌協(xié)同控藻作用研究
　　培養(yǎng)銅綠微囊藻至對(duì)數(shù)期，加入2μg/mL靈菌紅素和1/5(v/v)藻毒素降解菌群，檢測(cè)藻密度和胞外藻毒素，研究靈菌紅素-藻毒素降

7、解菌群的協(xié)同作用。繼而，分別研究藻毒素降解菌群含量、靈菌紅素濃度、溫度、加入時(shí)間間隔對(duì)協(xié)同作用的影響。加入2.5μg/mL靈菌紅素和不同體積菌株a7，研究二者協(xié)同作用效果及菌量影響因素。構(gòu)建粘質(zhì)沙雷氏菌-藻毒素降解菌群，粘質(zhì)沙雷氏菌-菌株a7，粘質(zhì)沙雷氏菌和LB試驗(yàn)及對(duì)照組，驗(yàn)證協(xié)同作用體系在模擬湖水中的作用效果。結(jié)果顯示，靈菌紅素和藻毒素降解菌群協(xié)同作用時(shí)，藻密度值最低，胞外MC-LR濃度逐步降低至檢測(cè)限以下。1/5(v/v)藻毒素降