硫氧還原蛋白與腫瘤蛋白在WSSV感染中作用及凡納濱對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后代謝物的變化.pdf

1、白斑綜合征病毒（WSSV）是一個(gè)嚴(yán)重影響對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的病毒，它于1992年首先發(fā)現(xiàn)于東南亞地區(qū)，此后相繼在世界范圍內(nèi)傳播開(kāi)來(lái)。由于其可以侵染的宿主范圍非常廣泛，所以每年都會(huì)給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病毒可以侵入多種宿主，包括多種水產(chǎn)動(dòng)物，如對(duì)蝦、蟹、淡水蝦和小龍蝦、以及水生節(jié)肢動(dòng)物和浮游動(dòng)物[5-6]。
　　本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)分子生物學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)的一些方法，來(lái)研究硫氧還原蛋白 Thiordoxin（TRX）和腫瘤蛋白o(hù)nopr

2、otein（OP）與WSSV的作用情況，并通過(guò)1H NMR核磁共振光譜分析法分析感染了WSSV的凡納濱對(duì)蝦代謝產(chǎn)物的變化情況，以及TRX、LvP38、CAT和POD四種基因在凡納濱對(duì)蝦感染了WSSV后的變化情況，從而來(lái)進(jìn)一步的探討WSSV的治病機(jī)理[1-4]。
　　Part1：硫氧還原蛋白Thiordoxin（TRX），是一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)抗氧化蛋白，它具有一系列生物學(xué)功能。有研究表明，TRX的基因表達(dá)量在感染 WSSV的動(dòng)物體內(nèi)呈

3、上升趨勢(shì)。然而，TRX在 WSSV感染中的作用及對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響尚不清楚。序列分析表明，TRX可以與WSSV上的結(jié)構(gòu)蛋白WSSV030（VP362）和WSSV454（TK-TMK）相互作用。本部分通過(guò)原核表達(dá)成功獲得TRX、VP362和TK，并用Far western blot和ELISA方法證明他們之間確實(shí)可以相互作用。通過(guò)絕對(duì)定量以及相對(duì)定量的分析表明，TRX蛋白的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)IKK、LvP38和STAT這些免疫相關(guān)的基因和細(xì)胞

4、信號(hào)通路的相關(guān)基因在感染W(wǎng)SSV對(duì)蝦體內(nèi)的基因表達(dá)量，并且在WSSV感染對(duì)蝦體內(nèi)，TRX基因與VP28基因的相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)。體外中和試驗(yàn)表明 TRX在對(duì)蝦體內(nèi)過(guò)表達(dá)后，可加快 WSSV在對(duì)蝦體內(nèi)的復(fù)制，并加快感染W(wǎng)SSV的對(duì)蝦的死亡，說(shuō)明TRX具有促進(jìn)WSSV感染的作用。
　　Part2：本部分實(shí)驗(yàn)主要研究腫瘤蛋白（oncoprotein）OP（與NDK序列相同）與WSSV的作用關(guān)系。首先通過(guò)原核表達(dá)獲得 OP表達(dá)產(chǎn)物，親和層

5、析純化出 OP蛋白。采用Far western blot和ELISA方法研究OP與WSSV結(jié)構(gòu)蛋白的作用，結(jié)果表明OP與WSSV膜蛋白 VP28有相互作用。然后再通過(guò)體外注射 OP蛋白于凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)，測(cè)量病毒拷貝數(shù)以及mRNA水平上IE1和VP28基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明OP蛋白可促使WSSV在對(duì)蝦體內(nèi)的復(fù)制，并促使WSSV感染的對(duì)蝦體內(nèi)的IE1和VP28基因表達(dá)量升高。體內(nèi)中和試驗(yàn)表明，注射OP蛋白的感染W(wǎng)SSV的對(duì)蝦，死亡時(shí)間早

6、于其他實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。RNA干擾實(shí)驗(yàn)表明，注射dsRNA-OP的感染組對(duì)蝦，死亡時(shí)間明顯延后于正常感染W(wǎng)SSV的對(duì)蝦和其他實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。由此推斷，OP蛋白可以加快WSSV在對(duì)蝦體內(nèi)的增殖，且OP蛋白可能是一種WSSV促死蛋白。
　　Part3：本部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)1H NMR光譜分析法分析感染W(wǎng)SSV的凡納濱對(duì)蝦和健康的對(duì)蝦的代謝差異。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要是各取WSSV感染48h后的對(duì)蝦和注射PBS緩沖液48 h后的健康對(duì)蝦的肝胰腺組織進(jìn)行NMR和多

7、元數(shù)據(jù)分析（包括主成分分析PCA，正交偏最小二乘分析模型OPLS-DA modle），發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)蝦相比，WSSV感染的對(duì)蝦的肝胰腺組織中，醋酸鹽、脂質(zhì)（-CH2-CH=CH-）、賴氨酸、酪氨酸、N-乙?；堑鞍椎暮亢艿?，而α-葡萄糖和β-葡萄糖的含量則非常高，這表明WSSV感染干擾了對(duì)蝦對(duì)氨基酸的吸收，蛋白代謝以利于病毒復(fù)制。本研究結(jié)果有助于深入了解病毒致病機(jī)制。
　　Part4：為比較凡納濱對(duì)蝦與氧化反應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因在

8、WSSV感染中的變化情況，本部分實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR的技術(shù)分析白斑綜合征病毒（WSSV）感染凡納濱對(duì)蝦6、12、24、48、72五個(gè)時(shí)間段后鰓和類淋巴組織中硫氧還原蛋白（TRx）、p38信號(hào)通路（LvP38）、過(guò)氧化氫酶（CAT）以及過(guò)氧化物酶（POD）四種基因在mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果表明，感染組對(duì)蝦的類淋巴組織中 TRx、LvP38、CAT、POD這四種基因在72 h時(shí)表達(dá)量最高，與對(duì)照組形成顯著性差異(P<0.05)；