凡納濱對(duì)蝦熱休克蛋白60、70和90與WSSV的相互作用.pdf

1、白斑綜合征病毒(WSSV)已經(jīng)給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的危害,造成了巨大的損失。為了了解其致病機(jī)制,本論文主要針對(duì) HSP60、HSP70和HSP90與WSSV的相互作用進(jìn)行研究,主要內(nèi)容如下:
　　(1)為了研究凡納濱對(duì)蝦熱休克蛋白60(HSP60)在WSSV感染中的作用,將其克隆至表達(dá)載體 pBAD/gⅢA中,構(gòu)建的重組載體pBAD/gIIIA-HSP60轉(zhuǎn)入到大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)L-阿拉伯糖誘導(dǎo)約4h后,采用SD

2、S-PAGE及Western Blot分析,結(jié)果表明重組蛋白HSP60得到表達(dá)。經(jīng)Co2+親和層析純化獲得目的蛋白,制備HSP60的兔抗抗體,將抗體進(jìn)行純化測(cè)定效價(jià)。Far Western檢測(cè),ELISA和間接免疫熒光分析表明 HSP60與VP12、VP24、VP26、VP39、VP90有相互作用。將HSP60的抗體注射到對(duì)蝦體內(nèi)后再進(jìn)行WSSV感染,通過(guò)計(jì)算累計(jì)死亡率觀察到在WSSV感染的前期,抗體對(duì)對(duì)蝦有一定保護(hù)作用。將HSP60注

3、射入對(duì)蝦體內(nèi)再進(jìn)行WSSV感染實(shí)驗(yàn),通過(guò)累計(jì)死亡率的計(jì)算觀測(cè)到 HSP60對(duì)對(duì)蝦有一定的保護(hù)作用,并通過(guò)Real-Time PCR來(lái)檢測(cè)感染后對(duì)蝦的類(lèi)淋巴、鰓內(nèi)STAT基因的表達(dá)情況和鰓中的WSSV拷貝數(shù),得知HSP60可能在WSSV感染的前期起到保護(hù)作用。
　　(2)為了研究凡納濱對(duì)蝦熱休克蛋白70(HSP70)在WSSV感染中的作用,基于熱休克蛋白的結(jié)構(gòu),將HSP70分為兩段HSP70A和HSP70P,分別克隆至表達(dá)載體pBA

4、D/gⅢA中,構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)入到大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)L-阿拉伯糖誘導(dǎo),采用SDS-PAGE及Western Blot分析,結(jié)果表明重組蛋白HSP70A和HSP70P得到表達(dá)。經(jīng)Co2+親和層析純化獲得目的蛋白。Far Western分析表明,HSP70A和 HSP70P與重組表達(dá)的VP24、VP26有相互作用,ELISA結(jié)果說(shuō)明在設(shè)定濃度范圍內(nèi),HSP70A和HSP70P與VP24、VP26的作用與濃度成正相關(guān)。間接免疫

5、熒光分析表明,HSP70與VP24、VP26共定位于對(duì)蝦血細(xì)胞上。VP24、VP26與HSP70作用降低HSP70的ATPase活性。該研究為深入研究HSP70在WSSV感染中的作用提供依據(jù)。
　　(3)為了研究凡納濱對(duì)蝦熱休克蛋白90(HSP90)在WSSV感染中的作用,基于其自身的結(jié)構(gòu),將HSP90分為兩段即HSP90N和HSP90P。分別將其克隆至表達(dá)載體pBAD/gⅢA中,構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)入到大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞中

6、,經(jīng)誘導(dǎo)后采用SDS-PAGE及Western Blot分析,結(jié)果表明重組蛋白HSP90N和HSP90C均得到表達(dá)。經(jīng)Co2+親和層析純化獲得目的蛋白,制備HSP90C的兔抗抗體,將抗體進(jìn)行純化測(cè)定效價(jià)。通過(guò)Far Western檢測(cè),證明HSP90C的抗體可以和HSP90N、HSP90C發(fā)生相互作用。ELISA反應(yīng)和間接免疫熒光分析表明HSP90N和HSP90C與VP12、VP24、VP26、VP90之間有相互作用。將HSP90N和H

7、SP90C進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn),通過(guò)累計(jì)死亡率的計(jì)算觀測(cè)到HSP90C對(duì)對(duì)蝦有一定的保護(hù)作用,Real-Time PCR檢測(cè)感染后對(duì)蝦鰓中的WSSV拷貝數(shù),表明HSP90C可能在WSSV感染的前期起到保護(hù)作用。
　　(4)采用Real-Time PCR技術(shù)分析WSSV感染凡納濱對(duì)蝦不同時(shí)段鰓、腸、肝胰腺、肌肉、類(lèi)淋巴和血細(xì)胞組織中熱休克蛋白 HSP60和HSP90基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果顯示,HSP60和HSP90在這六個(gè)組織中都