對磷酸原激酶家族中精氨酸激酶與肌酸激酶抑制作用的研究.pdf

1、磷酸原激酶家族成員不但廣泛存在于動物體內(nèi)，而且對于生物能的代謝、貯存和利用發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。近年來，磷酸原激酶的抑制作用研究越來越受到關(guān)注，不同來源的磷酸原激酶家族成員因其在能量代謝中的重要地位而成為研究酶抑制作用的靶目標(biāo)。因此，對磷酸原激酶，尤其是兩種最為常見的磷酸原激酶--精氨酸激酶(AK)和肌酸激酶(CK)的結(jié)構(gòu)與功能的研究，以及對其抑制作用機(jī)制的研究，可以使人們(1)更為深入地理解生物體內(nèi)的能量代謝過程；(2)針對有害昆蟲體

2、內(nèi)AK有效抑制劑的篩選，可以為開發(fā)環(huán)境友好的殺蟲劑提供新的途徑；(3)深入研究疾病或衰老等發(fā)生過程中磷酸原激酶CK的活性抑制機(jī)理。
　　 磷酸原激酶是一個具有高度保守性的家族，能夠可逆地催化磷酸原(如磷酸肌酸和磷酸精氨酸)的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)。肌酸激酶(Crealine Kinase，ATP:Creatinephosphotransferase，EC2.7.3.2)和精氨酸激酶(Arginine Kinase，ATP：Arginine

3、phosphotransferase，EC2.7.3.3)是磷酸原激酶家族中兩個重要成員。本文主要研究了作為存在于自然界的重要重金屬離子之一的Ag+對精氨酸激酶(AK)的抑制作用和丙烯酰胺對肌酸激酶(CK)的影響。同時，還考察了鋅離子對HBCK活力的影響，以及研究了甘氨酸和脯氨酸對鋅離子引起HBCK聚沉的緩解作用。
　　 對文獻(xiàn)中精氨酸激酶分離方法進(jìn)行了改進(jìn)，從中國對蝦(Chinese Shrimp，F(xiàn)enneropenaeus

4、 chinensis)肌肉中分離純化得到了精氨酸激酶。采用SephacrylS-300分子篩層析和DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析進(jìn)一步得到了純化的AK樣品，測得其分子量為43,000Da，酶對腺苷三磷酸(ATP)的Km(ATP)值為2.38，對精氨酸(Arg)的Km(Arg)值為2.62，最適pH為8.2。
　　 論文還研究了Ag＋對中國對蝦精氨酸激酶(AK)活性的影響。結(jié)果表明，Ag+以劑量依賴

5、的方式抑制AK的活性(IC50=15μM)。動力學(xué)研究表明，Ag+對AK的抑制是可逆的，其抑制類型為非競爭性抑制(Ki=2.8μM)。熒光光譜結(jié)果表明，在導(dǎo)致AK失活的濃度范圍內(nèi)，Ag+并不引起AK三級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，但圓二色光譜顯示其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了輕微的變化。這些實驗結(jié)果說明AK的活性部位具有柔性，其活性的完全喪失早于分子整體結(jié)構(gòu)發(fā)生的明顯變化。本課題的開展有助于揭示Ag+對AK的抑制機(jī)理，并能使我們更深入地了解Ag+對精氨酸激酶的

6、影響。
　　 丙烯酰胺廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)，在日常生活的食物烹飪和加工過程中也可能產(chǎn)生。丙烯酰胺對人體有害，人腦型肌酸激酶(HBCK)被認(rèn)為是丙烯酰胺的重要作用靶標(biāo)之一。因此，論文通過酶活力測定、光譜學(xué)技術(shù)和分子模擬等方法研究了丙烯酰胺對HBCK的作用，探究了丙烯酰胺對HBCK的活性和結(jié)構(gòu)的影響以及兩者之間可能的結(jié)合位點。
　　 與兔源CK(RBCK)相比，HBCK的活性在濃度低數(shù)倍的丙烯酰胺作用下可被完全抑制，并且在丙烯酰

7、胺誘導(dǎo)的失活過程與結(jié)構(gòu)變化方面表現(xiàn)出不同的特征。丙烯酰胺的結(jié)合位點位于CK分子的N-端結(jié)構(gòu)域和C-端結(jié)構(gòu)域之間的裂隙之中，谷氨酸(Glu)232是結(jié)合的關(guān)鍵性氨基酸殘基之一，并認(rèn)為丙烯酰胺對CK的影響具有同工酶特異性和物種特異性。
　　 另外，論文還研究了鋅離子對HBCK活力的影響，結(jié)果表明，低濃度的鋅離子導(dǎo)致HBCK的失活；高濃度的鋅離子可引起HBCK的聚沉，并且發(fā)現(xiàn)這種聚沉具有溫度、酶濃度及鋅離子濃度依賴性。為此，考察了添加