褐飛虱內參基因的篩選及精氨酸激酶基因的分子特性研究.pdf

1、褐飛虱Nilaparvatalugens(brownplanthopper，BPH)是水稻上的重要害蟲之一，在我國南方部分地區(qū)和長江中下游地區(qū)近年來褐飛虱經常暴發(fā)成災，對我國水稻生產和糧食安全構成嚴重威脅。目前，對于褐飛虱的控制以化學防治為主，然而化學藥劑導致的環(huán)境污染問題日益嚴重，因此當前害蟲防治的研究熱點集中在尋求環(huán)境友好的防止新途徑。與此同時，RNAi技術已經廣泛地應用于各種生物體基因功能的研究，這一技術成功地闡明了多種昆蟲的基因

2、功能。利用該技術分析基因功能的同時，也為農業(yè)害蟲的生物防治開辟了RNAi沉默靶標基因的新途徑。在RNAi的研究過程中，利用實時熒光定量PCR分析靶標基因mRNA水平是檢測基因沉默效果的重要手段，本研究詳細分析評估了不同實驗條件下（不同發(fā)育時期、不同組織部位、不同地理種群、不同溫度脅迫、不同藥劑處理、不同食物飼喂和饑餓處理）褐飛虱8種常用持家基因actin1(ACT)、muscleactin(MACT)、ribosomalproteinS

3、11(RPS11)、ribosomalproteinS15e(RPS15)、alpha2-tubulin(TUB)、elongationfactor1delta(EF)、18SribosomalRNA(18S)和argininekinase(AK)的表達穩(wěn)定性。并且，克隆褐飛虱nlak基因的全長cDNA，分析nlak基因mRNA的組織分布和發(fā)育表達模式，構建昆蟲桿狀病毒重組質粒表達NlAK重組蛋白，通過RNAi探討nlak基因作為分子靶

4、標的可能性，為深入研究精氨酸激酶基因的表達與調控規(guī)律，闡明昆蟲體內能量的代謝、貯存和利用等調控機制提供重要的理論依據，并且為利用RNAi這一新技術有效防治褐飛虱提供理論基礎。研究結果如下:
　　一、褐飛虱內參基因的篩選
　　不同發(fā)育時期各內參基因穩(wěn)定性的綜合排序從穩(wěn)定到不穩(wěn)定依次為:RPS15，RPS11，TUB，EF，18S，AK，ACT，MACT。若要采用多內參校正，需要選取RPS15、TUB、18S和EF這四個基因;不

5、同組織部位各內參基因穩(wěn)定性的綜合排序從穩(wěn)定到不穩(wěn)定依次為:RPS11，TUB，RPS15，18S，ACT，MACT，EF，AK。若要采用多內參校正，需要選取RPS11、18S和RPS15這三個基因;不同地理種群各內參基因穩(wěn)定性的綜合排序從穩(wěn)定到不穩(wěn)定依次為:TUB，RPS11，EF，RPS15，AK，ACT，18S，MACT。采用多內參校正時，需要選取RPS11、EF和RPS15這三個基因;不同溫度脅迫下各內參基因穩(wěn)定性的綜合排序從穩(wěn)定

6、到不穩(wěn)定依次為:RPS15，TUB，EF，RPS11，AK，MACT，18S，ACT。采用多內參校正時，需要選取RPS15、TUB和EF這三個基因;不同藥劑處理下各內參基因穩(wěn)定性的綜合排序從穩(wěn)定到不穩(wěn)定依次為:RPS11，EF，TUB，RPS15，18S，AK，MACT，ACT。采用多內參校正時，需要選取RPS11、EF和TUB這三個基因;不同食物飼喂時各內參基因穩(wěn)定性的綜合排序從穩(wěn)定到不穩(wěn)定依次為:RPS15，TUB，RPS11，EF

7、，AK，18S，ACT，MACT。采用多內參校正時，需要選取RPS15、TUB、EF和RPS11這四個基因;饑餓處理下各內參基因穩(wěn)定性的綜合排序從穩(wěn)定到不穩(wěn)定依次為:RPS11，TUB，RPS15，AK，18S，EF，ACT，MACT。采用多內參校正時，需要選取RPS11、AK和EF這三個基因;對所有處理的樣品數(shù)據進行綜合分析，結果發(fā)現(xiàn)各內參基因穩(wěn)定性的綜合排序從穩(wěn)定到不穩(wěn)定依次為:RPS11，RPS15，EF，TUB，AK，18S，A

8、CT，MACT。此結果對于褐飛虱中基因表達分析具有重要意義，并且為進一步分析褐飛虱和其他生物內參基因穩(wěn)定性奠定了基礎。
　　二、褐飛虱精氨酸激酶基因的分子特性研究
　　1.褐飛虱精氨酸激酶基因(nlak)的克隆與分析
　　采用PCR、TA克隆、測序和拼接，獲得了nlak基因的完整編碼區(qū)序列，并通過5'-RACE和3'-RACE獲得5'端和3'端非翻譯區(qū)(UntranslatedRegions，UTR)序列。克隆到的nl

9、ak基因cDNA全長為1377bp，含有一個完整的1071bp的開放閱讀框序列（Openreadingframe，ORF），編碼356個氨基酸殘基。其中，CPTNLGT位于nlak氨基酸序列第270-276位，是精氨酸激酶的活性中心。根據Prosite軟件分析得出其蛋白質分子量為39.81kDa，等電點為5.69。
　　2.重組AcNPV-NlAK在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中的表達
　　將同源重組的AcNPV-NlAK病毒轉染健康的

10、昆蟲sf21細胞系，獲得第一代重組AcNPV-NlAK病毒。該重組病毒能夠繼續(xù)感染新的健康的sf21細胞，在感染后的第7天可以收集到重組AcNPV-NlAK蛋白。利用抗6-His兔多克隆抗體進行WesternBlotting，檢測到重組NPV-NlAK蛋白在sf21細胞中成功表達。
　　3.nlak基因在褐飛虱體內的表達分析
　　qRT-PCR和酶活性檢測結果表明nlak基因在褐飛虱各個發(fā)育時期均有表達，褐飛虱卵期的nlak

11、基因表達量遠低于其他各個時期，1齡若蟲和2齡若蟲中表達量顯著高于其它齡期若蟲，并且在2齡若蟲中的表達量為整個發(fā)育時期最高。此外，在褐飛虱成蟲的各組織部位中nlak基因均有表達，無論在雌成蟲還是雄成蟲體內，頭部的nlak基因表達量最高，其次是胸部，而腹部的表達量明顯低于頭部和胸部。并且，對于整個蟲體而言，nlak基因在雄成蟲體內的表達量遠大于雌成蟲。
　　4.nlak基因沉默后對褐飛虱的影響
　　采用飼喂法將體外合成的nlak

12、基因dsRNA通過人工飼料導入褐飛虱體內，通過對死亡率的統(tǒng)計、qRT-PCR和酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，在飼喂初期dsRNA對nlak基因干擾效果比較明顯。不同濃度和不同片段的dsRNA飼喂結果均表明，攝取dsRNA的褐飛虱第2天出現(xiàn)死亡率上升、mRNA水平下降和酶活力降低的現(xiàn)象。第3天開始死亡率變化趨于平緩，第4天開始mRNA水平變化也趨于平緩，nlak基因的表達量隨著RNAi處理時間的延長呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。
　　綜上所述，褐飛虱R