轉(zhuǎn)Cry30Fa1基因抗褐飛虱水稻的研究.pdf

1、本研究以優(yōu)良的水稻恢復(fù)系蜀恢818(R818)為受體材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將本實(shí)驗(yàn)室克隆的抗褐飛虱基因Cry30Fa1轉(zhuǎn)入其中，通過(guò)連續(xù)自交和DNA檢測(cè)在T6代獲得了目的基因純合的轉(zhuǎn)基因株系。通過(guò)目的基因PCR檢測(cè)和抗性表達(dá)鑒定，確定T5、T6代轉(zhuǎn)基因材料中的選擇標(biāo)記基因Hyg(R)和抗蟲(chóng)基因Cry30Fa1，最終篩選到無(wú)選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因水稻株系。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Cry30Fa1基因的轉(zhuǎn)錄情況。同時(shí)，基于

2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)也檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因材料中的Cry30Fa1基因拷貝數(shù)。采用Western Blot檢測(cè)Cry30Fa1基因蛋白表達(dá)情況。采用苗期集團(tuán)抗蟲(chóng)性鑒定法、苗期單株抗蟲(chóng)性鑒定法和田間抗蟲(chóng)性鑒定法，分別對(duì)3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了抗蟲(chóng)性分析，篩選到中抗以上水平的抗褐飛虱轉(zhuǎn)基因水稻株系。此外，我們還對(duì)T6代轉(zhuǎn)基因水稻株系的主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行了調(diào)查。主要結(jié)果如下:
　　1.對(duì)T5代的184個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行Cry30Fa1基因的PCR檢測(cè)

3、，發(fā)現(xiàn)其中150個(gè)株系含有Cry30Fa1基因，而且T6代跟蹤檢測(cè)中篩選到29個(gè)目的基因純合的轉(zhuǎn)基因株系。通過(guò)對(duì)29個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了Hyg(R)基因PCR檢測(cè)和浸泡表達(dá)檢測(cè)，最終獲得了15個(gè)無(wú)選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因株系。
　　2.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，本研究對(duì)29個(gè)T6代轉(zhuǎn)基因株系的Cry30Fa1基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，所有轉(zhuǎn)基因株系的Cry30Fa1基因在轉(zhuǎn)錄水平上均有表達(dá)，但表達(dá)量差異較大，相對(duì)表達(dá)

4、量在0.19-8.53之間。
　　3.通過(guò)Western Blot技術(shù)，本研究對(duì)29個(gè)T6代轉(zhuǎn)基因株系Cry30Fa1基因在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中沒(méi)有檢測(cè)到Bt蛋白質(zhì)，余下的24個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的Bt蛋白均有表達(dá)，但轉(zhuǎn)基因株系中Bt蛋白表達(dá)量存在較大差異，分布在0.13到11.6之間。
　　4.通過(guò)分析了轉(zhuǎn)基因植株中Cry30Fa1基因拷貝數(shù)，本研究發(fā)現(xiàn)29個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中Cry30Fa1基因拷貝

5、數(shù)存在較大差異，但有15個(gè)株系的拷貝數(shù)屬于低拷貝的株系。
　　5.采用苗期集團(tuán)抗蟲(chóng)性鑒定法和田間抗蟲(chóng)性鑒定法對(duì)其中3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了抗蟲(chóng)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苗期抗性均達(dá)到了7級(jí)，屬于中感材料;田間抗性達(dá)到3-5級(jí)，屬于中抗到抗的材料。同時(shí)，采用苗期單株抗蟲(chóng)性鑒定法，對(duì)以上3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了殺蟲(chóng)性分析，結(jié)果表明，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中的褐飛虱死亡率顯著高于親本R818，這說(shuō)明了轉(zhuǎn)基因株系增加了殺蟲(chóng)能力。
　　6.通過(guò)對(duì)29個(gè)轉(zhuǎn)基因

6、株系主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行分析，結(jié)果表明，外源Bt基因?qū)λ局旮哂绊懽畲螅?9個(gè)株系與親本之間存在顯著性差異;外源Bt基因?qū)ζ渌r(nóng)藝性狀如抽穗期、有效分蘗數(shù)、主穗長(zhǎng)、結(jié)實(shí)率、千粒重等的影響較小。通過(guò)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)性狀得到改良的株系比性狀變差的株系多，這說(shuō)明通過(guò)分子水平檢測(cè)和田間選育工作相結(jié)合，總會(huì)選到和親本相似農(nóng)藝性狀甚至是優(yōu)于親本的轉(zhuǎn)基因株系。
　　目前，正在對(duì)余下的26個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行全面抗蟲(chóng)性分析，以期獲得更多抗褐飛虱的轉(zhuǎn)基因株系