對褐飛虱有效的新型Bt Cry毒素的改造.pdf

1、蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis, Bt），是目前應(yīng)用最為廣泛的微生物殺蟲劑，在 Bt所產(chǎn)生的多種殺蟲毒素中，Cry毒素是當前研究最為深入且應(yīng)用最為廣泛的一種，cry基因也已經(jīng)被廣泛應(yīng)用與轉(zhuǎn)基因作物中，成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、線蟲等Bt Cry毒素靶標昆蟲的一種有效的途徑，從而減少了對環(huán)境有負作用的化學農(nóng)藥的使用。
　　然而，Cry毒素蛋白的殺蟲譜僅局限于鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等特定靶標昆

2、蟲，對于半翅目刺吸式口器的蚜蟲、飛虱、葉蟬等昆蟲暫時還沒有有效 Cry毒素的報道。隨著能夠表達Cry毒素的轉(zhuǎn)基因作物的大量種植及Bt制劑在農(nóng)田中的廣泛使用，鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等Cry靶標昆蟲能夠得到有效控制，而飛虱、葉蟬、蚜蟲等半翅目非Bt靶標昆蟲則依舊需要使用化學農(nóng)藥進行防治，甚至有大爆發(fā)的可能。因此，急需尋找或開發(fā)一種能夠?qū)Υ祟惏氤崮亢οx具有毒性作用的新型Cry毒素。
　　本研究首先克隆、表達并制備了可溶的Cry1Ab毒素

3、蛋白，利用獲得的Cry1Ab蛋白，制備了高效價的兔抗Cry1Ab的多克隆抗血清。而后，利用膜飼喂法測定了Cry1Ab蛋白對重要水稻害蟲褐飛虱（Nilaparvata lugens）的毒性作用。并結(jié)合體外水解與Pull-down技術(shù)，利用免疫印跡法分析了Cry1Ab毒素對褐飛虱只有低毒作用的原因進行了分析，發(fā)現(xiàn)Cry1Ab毒素能夠在褐飛虱中腸內(nèi)被水解且能夠與褐飛虱中腸刷狀緣膜囊泡（brash border membrane vesicle

4、, BBMV）結(jié)合。因此，推斷Cry1Ab毒素對褐飛虱鮮有毒性作用的原因是其無法與正確的受體蛋白結(jié)合所致。
　　另一方面，本研究利用蚜蟲中腸內(nèi)膜結(jié)合短肽對Cry1Ab毒素domainⅡ中決定受體識別的3個loop進行逐一替換，并測定了替換loop后的三株Cry蛋白對鱗翅目小菜蛾幼蟲的毒性作用。研究發(fā)現(xiàn)，在Cry1Ab domainⅡ中決定受體識別的3個loop分別被替換后，Cry1Ab毒素對小菜蛾的毒性作用受到不同程度的影響，其中

5、loop2被替換后，Cry1Ab對小菜蛾的毒性作用下降最為明顯，LC50達到32.25μg/mL。由此可以推斷，對于Cry1A毒素而言，在受體識別功能作用上domainⅡ中的loop2起到的作用最大。
　　為了獲得對褐飛虱具有較好毒性作用的新型Cry毒素，本研究利用噬菌體短肽文庫展示技術(shù)篩選出了能夠與水稻褐飛虱中腸內(nèi)膜結(jié)合的短肽 P2S。通過將P2S與加強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent prot

6、ein, EGFP）基因的融合，制備了P2S-EGFP融合蛋白，利用Pull-down技術(shù)及熒光顯微鏡觀察，驗證了P2S與褐飛虱中腸內(nèi)膜及BBMV較強的結(jié)合能力。隨后，本研究利用分子區(qū)域替換技術(shù)，使用能夠與褐飛虱中腸內(nèi)膜結(jié)合的短肽 P2S及本實驗室早先篩選出的能夠與褐飛虱中腸BBMV結(jié)合的短肽P1Z分別對Cry1Ab決定受體識別的3個loop分別進行了替換獲得了六株新型的cry基因，并對六株新型Cry蛋白進行了原核表達及純化。通過體外水

7、解、Pull-down體外結(jié)合及膜飼喂法生測，篩選出一株在褐飛虱中腸中最穩(wěn)定，與褐飛虱中腸BBMV結(jié)合能力最強且對褐飛虱毒性作用最好的新型Cry毒素Cry1Ab-2S。該毒素將Cry1Ab對褐飛虱的毒性作用提高了近13倍。而后，本研究還利用透射電鏡對取食了Cry1Ab-2S的褐飛虱中腸超微組織進行觀察，發(fā)現(xiàn)其中腸內(nèi)膜細胞有明顯被消解的現(xiàn)象，證明了Cry1Ab-2S對褐飛虱的良好毒性作用。本研究為利用基因工程定向改造Cry毒素，為發(fā)展針對

8、特定害蟲作用的Cry毒素研究提供了可行的途徑；為Cry毒素及其他昆蟲毒素在昆蟲體內(nèi)受體的研究提供了新的思路；為應(yīng)用分子工程手段發(fā)展新型害蟲毒素提供理論和應(yīng)用基礎(chǔ)；為Cry和其它昆蟲毒素的毒理機制研究提供新的手段。
　　本研究的特色與創(chuàng)新點主要包括：
　　1.分析了Cry毒素對半翅目褐飛虱等刺吸式口器害蟲無法產(chǎn)生良好毒性作用的原因；
　　2.證明了domainⅡ三個受體識別loop對Cry1Ab毒性影響的重要性；