抗白葉枯轉(zhuǎn)基因水稻的培育和利用表達(dá)譜芯片對水稻抗褐飛虱機(jī)制的研究.pdf

1、Part1:在水稻抗病蟲育種中，抗性基因資源是最重要的，但是在實際的生產(chǎn)應(yīng)用中，尤其是在現(xiàn)在的雜交育種中，與顯性性狀基因相比隱性的抗性資源往往難以利用。但是與顯性性狀相比，隱性基因可能賦予了作物對不同生理小種病原菌或不同生物型害蟲新的抗性機(jī)制。水稻抗白葉枯病隱性基因Xa13，同時也被證明參與了花藥的發(fā)育，目前已被克隆并且其抗性機(jī)制最近也已被解析。在本研究中我們希望將xa13基因隱性抗病的表型轉(zhuǎn)變?yōu)轱@性表型，希望能借此促進(jìn)xa13基因在育

2、種中的應(yīng)用。我們通過使用人工小RNA沉默技術(shù)去干涉Xa13基因的表達(dá)，并且使用組織特異性的啟動子（Osrbcsp和Atrbcsp）避免人工小RNA（amiA和amiB）在花藥中的表達(dá)，從而保證Xa13基因在花藥的發(fā)育過程中正常的行使功能。本實驗最后得到了符合預(yù)期的高抗白葉枯且結(jié)實率正常的轉(zhuǎn)基因水稻，證明我們在轉(zhuǎn)基因植株中達(dá)到了特異性沉默Xa13基因的效果。本研究為如何在生產(chǎn)育種上利用xa13這種隱性且一因多效的基因提供了一個良好的思路。

3、
　　本實驗研究成果如下:
　　1)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，獲得明恢63轉(zhuǎn)基因T0代主要的4個片段分別得到PCR陽性苗為31（Osrbcsp-amiB），27(Atrbscsp-amiA)，38（Osrbcsp-amiB和25(Atbcsp-amiB)。
　　2)接種白葉枯病菌PXO99兩周后，野生型明恢63病斑長和病斑面積比例分別為22.75±2.12cm和88.5±7.0％。與此相比，表達(dá)amiB的轉(zhuǎn)基因片段

4、表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗性，Osrbcsp+amiB和Atrbcsp+amiB分別有84.2％(32/38)和80.0％(20/25)的陽性家系表現(xiàn)出了白葉枯抗性，甚至分別有50％(19)和32％(8)達(dá)到了高抗水平，即病斑長度小于3 cm;但是轉(zhuǎn)amiA片段抗性效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于轉(zhuǎn)amiB的片段。
　　3)通過PAGE Northern實驗得知，amiA和amiB都在轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)。我們還進(jìn)行了Xa13基因的降解是否由于amiRNA介導(dǎo)的

5、5'RACE驗證實驗，結(jié)果顯示amiB轉(zhuǎn)基因片段中分離的Xa13 mRNA的5'端序列的12個克隆測序結(jié)果完全一致，顯示Xa13在與amiB互補(bǔ)序列的第10和11個堿基之間被切斷而降解。但amiA-Xa13由于太靠近3'端，而無法設(shè)計合適的RACE引物從而無法獲得amiA剪切位點(diǎn)的直接結(jié)果。
　　4)為了驗證Atrbcsp和Osrbcsp的組織特異性，我們通過stem-loop primer特異性反轉(zhuǎn)錄了葉片和花藥中的amiRNA

6、，RT-PCR結(jié)果顯示花藥中amiRNA的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于葉片。我們進(jìn)一步進(jìn)行了qRT-PCR實驗，結(jié)果顯示同一植株背景下，4個片段中的amiRNA在葉片中的表達(dá)量為花藥中的162倍至1211倍。
　　5)我們選取了兩個Osrbcsp+amiB單拷貝家系，在T1代苗期進(jìn)行了PXO99的接種實驗，結(jié)果顯示隱性抗性性狀已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)轱@性性狀，T1代符合3∶1孟德爾分離比。潮霉素southern和amiB表達(dá)檢測結(jié)果與抗性表型表現(xiàn)出完全的共

7、分離。
　　Part2:褐飛虱是水稻的主要害蟲之一，且不受Bt殺蟲蛋白的影響，因此，從水稻種質(zhì)資源中挖掘抗性基因?qū)τ诤诛w虱的防治至關(guān)重要。RH(Rathu Henatu)是來自于斯里蘭卡的秈稻品種，對褐飛虱所有生物型均有良好和持久的抗性。前人的研究在RH中至少定位了4個抗性QTL區(qū)間。我們以RH為研究材料，以敏感水稻品種TN1為對照親本，通過表達(dá)譜芯片技術(shù)嘗試分析RH具有廣譜持久抗性的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，并確定了一批候選褐飛虱抗性相關(guān)

8、基因。結(jié)合芯片分析和前人定位的結(jié)果，在抗性QTL區(qū)間確定候選的抗性相關(guān)基因16個;通過表達(dá)模式分析，在4個QTL區(qū)段外，利用表達(dá)模式篩選出候選褐飛虱抗性相關(guān)基因22個。已有研究表明植物激素JA和SA信號途徑在植物對害蟲的抗性互作中扮演重要角色。我們分析了RH和TN1在褐飛虱脅迫誘導(dǎo)條件下JA和SA相關(guān)合成和信號途徑基因的表達(dá)模式，以及測定了相應(yīng)RH和TN1體內(nèi)JA和SA濃度的變化。
　　本研究主要結(jié)果如下:
　　1)內(nèi)參基因

9、是準(zhǔn)確檢測基因表達(dá)量的一個重要決定因素，選擇褐飛虱取食條件下穩(wěn)定的內(nèi)參對于準(zhǔn)確檢測褐飛虱取食特異性誘導(dǎo)基因具有重要意義。我們提取了qRT-PCR檢測中常用的8個內(nèi)參基因在不同樣品中的原始信號值，比較得知TBP和ubiquitin比較適合用于褐飛虱脅迫條件下的基因表達(dá)檢測。本研究所有的qRT試驗均選擇ubiquitin作為內(nèi)參基因。另外結(jié)合明恢63和珍汕97芯片結(jié)果我們也發(fā)掘了兩個表達(dá)穩(wěn)定的新內(nèi)參基因Os.1321.1.S1_a和Os.1

10、45.1.S1_aat。
　　2)我們使用了Affymetrix的水稻芯片，共檢測了57194個探針的表達(dá)量。芯片檢測結(jié)果表明，在針刺處理下，RH出現(xiàn)表達(dá)差異的探針數(shù)量明顯少于TN1。在6h，RH中針刺差異探針為92，而TN1中為211，表明TN1比RH對于單純物理傷害反應(yīng)更劇烈。針刺處理24h后，RH表達(dá)差異的探針為27，TN1中為38，無論是RH還是TN1的基因表達(dá)波動明顯恢復(fù)。
　　3)與針刺模擬的結(jié)果相反，接蟲6h，

11、RH中的差異探針數(shù)量(209)多于TN1(173)，且RH探針表達(dá)變化幅度較大(FC＞5)的探針數(shù)量為35，也明顯多于TN1中的12個。該結(jié)果表明，RH在褐飛虱為害初期被誘導(dǎo)表達(dá)的基因數(shù)量更多，對褐飛虱的反應(yīng)比TN1更迅速。接蟲24 h，RH中差異探針數(shù)上升到614，其中FC＞5的差異探針數(shù)由35上升至73;而TN1差異探針數(shù)上升到3356，其中FC＞5的差異探針數(shù)由12上升至349。
　　4)分別對6h和24 h時間點(diǎn)的RH和T

12、N1的針刺和接蟲處理的差異基因進(jìn)行韋恩圖分析，最終得到在RH特特異性表達(dá)，且褐飛虱特異性誘導(dǎo)的差異探針共192個，其中6h74個，24h152個。我們可以預(yù)期的是這192個RH中褐飛虱特異性誘導(dǎo)的基因中可能存在潛在的抗性相關(guān)基因。
　　5)為了解釋RH和TN1在接蟲條件下的差異基因在水稻抗蟲反應(yīng)中的功能，我們選取了T6N/T6C，T6P/T6C，T24P/T24C，R6N/R6C，R6P/R6C和R24P/24C六個組別的差異基因

13、用GOEAST進(jìn)行GO分析。GO分析結(jié)果分為BP(biology process)、CC(cellular component)和MF(molecular function)，在BP項目中無論是RH還是TN1中P值有顯著性差異的一級項目是response to stimulus和metabolic process，有顯著差異的是localization項目;在MF項目中，一級項目有極顯著差異的是catalytic activity，有顯

14、著差異的是binding和enzyme regulator activity;而CC項目中則無明顯特點(diǎn)。
　　6)芯片結(jié)果顯示茉莉酸(JA)途徑出現(xiàn)了17個差異基因表達(dá)模式，且都為上調(diào)，在RH和TN1中信號傳導(dǎo)途徑的差異基因都為JAZ類型的轉(zhuǎn)錄因子，他們是一類JA途徑的負(fù)調(diào)控因子，說明褐飛虱為害可能抑制水稻的JA信號途徑;水楊酸(SA)途徑的差異基因全部出現(xiàn)在合成代謝途徑中，除了與乙烯(ET)途徑共有的一個基因出現(xiàn)下調(diào)外，其余5個

15、差異基因全部上調(diào);而乙烯合成途徑的基因則表現(xiàn)出了下調(diào)的。
　　7)我們測定了褐飛虱取食不同時間點(diǎn)(6h，24 h以及48 h)，RH和TN1體內(nèi)的SA和JA（游離態(tài)）的變化情況。結(jié)果表明，褐飛虱取食6h后，RH中SA表現(xiàn)出了明顯的上調(diào)，但TN1中SA激素水平的變化反應(yīng)相對滯后，24h后才出現(xiàn)一定的上調(diào)，該結(jié)果表明在褐飛虱取食誘導(dǎo)下RH中SA水平的變化比TN1更快，幅度也更大。相反的，JA含量在兩個品種中，自24 h開始出現(xiàn)明顯下調(diào)