家蠶Foxo基因的克隆及其在絲腺程序性細(xì)胞死亡中的功能研究.pdf

1、FOXO在動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、代謝凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面有多種重要的生物功能。在哺乳動(dòng)物中，胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF/PI3K/FOXO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞分裂周期、死亡、應(yīng)激、解毒等不同的細(xì)胞進(jìn)程有關(guān)。
　　 家蠶（Bombyxmori）幼蟲至蛹變態(tài)期間發(fā)生著激烈的新舊組織更迭，其中包括幼蟲專性組織絲腺等迅速退化消亡。家蠶FOXO是否可能涉及家蠶特定組織狀態(tài)的細(xì)胞分化與凋亡調(diào)控，目前尚未有相關(guān)研究。為此，本文以家蠶幼蟲到蛹變態(tài)

2、期自發(fā)的和誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡(programmedcelldeath，PCD)為切入點(diǎn)，克隆了家蠶FOXO全長(zhǎng)基因，調(diào)查了Foxo基因的表達(dá)譜，并通過(guò)蛻皮激素及限食與饑餓處理，調(diào)查了個(gè)體絲腺組織和BmN細(xì)胞中Foxo基因及其上下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達(dá)變化情況，以及某些情況下絲腺中FOXO蛋白表達(dá)變化情況，從而希望能夠?qū)倚Q變態(tài)發(fā)育期PCD發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)制研究提供參考。獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1.家蠶Foxo基因的克隆

3、與鑒定
　　 通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室已有的Foxo基因部分序列進(jìn)行拼接驗(yàn)證，利用RACE技術(shù)克隆出家蠶Foxo基因全長(zhǎng)mRNA序列，長(zhǎng)3326bp，最長(zhǎng)ORF為1539bp。Foxo基因由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成，定位于家蠶9號(hào)染色體的nscaf2890上，編碼512個(gè)氨基酸，理論推測(cè)蛋白分子量55679.76，等電點(diǎn)6.08。FOXO蛋白在402～434氨基酸區(qū)域有2個(gè)由內(nèi)到外和1個(gè)由外到內(nèi)的跨膜螺旋。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，F(xiàn)OXO蛋白α螺旋

4、約占33.01％，延伸鏈約占7.81％，β轉(zhuǎn)角約占3.21％，隨機(jī)卷曲結(jié)構(gòu)約占56.05％。蛋白功能域（保守區(qū)）分析結(jié)果表明，F(xiàn)OXO蛋白92～181位氨基酸屬于FOXO家族特有的翼狀螺旋叉頭結(jié)構(gòu)域。各物種中FOXO序列前中段叉狀頭結(jié)構(gòu)部分高度保守；聚類分析結(jié)果表明家蠶FOXO蛋白歸屬于昆蟲的FOXO，且與鱗翅目昆蟲的親緣關(guān)系最近，與脊椎動(dòng)物的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，符合傳統(tǒng)意義上的進(jìn)化關(guān)系。因此，將所克隆的基因命名為家蠶Foxo基因（GenBa

5、nk登錄號(hào)：JQ081294）。
　　 2.家蠶Foxo基因的時(shí)空表達(dá)譜
　　 組織表達(dá)譜表明，F(xiàn)oxo基因在5齡第3日幼蟲各組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異性，F(xiàn)oxo基因在卵巢、頭部、脂肪體、血淋巴中的表達(dá)量都較高，在精巢、絲腺中的表達(dá)量都較低，家蠶5齡第3日幼蟲多組織芯片表達(dá)譜結(jié)果一致。
　　 發(fā)育時(shí)期表達(dá)譜表明，F(xiàn)oxo基因在催青加溫后的胚胎發(fā)育前期(E3～E4d)，以及2齡至預(yù)蛹期的表達(dá)量均較低，只有1

6、齡起蠶、蛹期和蛾期有較高量表達(dá)。在化蛹第3日時(shí)，雄蛹脂肪體中的表達(dá)量顯著高于雌蛹，雌雄表達(dá)差異非常大；羽化后雌蛾脂肪體中的Foxo基因均有高表達(dá)量，但仍低于雄蛾。
　　 3.FOXO與蛻皮激素誘導(dǎo)的PCD過(guò)程的關(guān)系
　　 為了研究蛻皮激素對(duì)家蠶Foxo基因表達(dá)的影響，調(diào)查了Foxo、EcR、E74A、InR、PTEN、Ywhaz(14-3-3zeta)、Torl、Atg8、Saposin-like等基因在家蠶幼蟲絲腺和B

7、mN細(xì)胞的表達(dá)量。在正常發(fā)育家蠶5齡期幼蟲絲腺中，根據(jù)EcR和E74A基因的表達(dá)量推測(cè)可知，絲腺中蛻皮激素含量的變化情況與血淋巴中一致，即5齡前期蛻皮激素含量一直維持低水平，在5齡第6日開始上升，進(jìn)入熟蠶期后絲腺中蛻皮激素含量增幅變大。同時(shí)Foxo基因表達(dá)量也在5齡第6日開始上升，在熟蠶期Foxo基因表達(dá)量也急速上升，以及FOXO蛋白表達(dá)量也升高。已有研究表明，20E對(duì)磷酸化水平起到抑制作用，且本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制FOXO活性的InR、Y

8、whaz的核酸水平的表達(dá)量在預(yù)蛹期相對(duì)較低，隨后的預(yù)蛹期凋亡相關(guān)基因E74A與Saposin-like的表達(dá)量迅速上調(diào)。因此推測(cè)，F(xiàn)OXO被20E誘導(dǎo)表達(dá)，并在熟蠶期最大程度地發(fā)揮其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)功能。
　　 對(duì)4齡第4日家蠶個(gè)體進(jìn)行外源20E注射之后，發(fā)現(xiàn)隨著蛻皮激素20E含量上升，F(xiàn)OXO基因和蛋白表達(dá)水平均上調(diào)；對(duì)BmN細(xì)胞進(jìn)行外源20E處理后，同樣發(fā)現(xiàn)20E誘導(dǎo)了Foxo基因上調(diào)表達(dá)。在Foxo基因表達(dá)量升高的同時(shí)

9、，E74A、Atg8與Saposin-like的表達(dá)量均升高，且相對(duì)于對(duì)照組始終保持較高水平的表達(dá)量，同時(shí)對(duì)BmN細(xì)胞熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)，BmN細(xì)胞的確在20E處理后發(fā)生了自噬和凋亡的現(xiàn)象。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，F(xiàn)OXO參與了蛻皮激素誘導(dǎo)的PCD過(guò)程。
　　 4.FOXO與饑餓誘導(dǎo)的PCD過(guò)程的關(guān)系
　　 為了研究限食與饑餓對(duì)家蠶Foxo基因表達(dá)的影響，調(diào)查了Foxo、InR、PTEN、Ywhaz(14-3-3zeta)、At

10、g8、Saposin-like等基因在家蠶幼蟲絲腺和BmN細(xì)胞的表達(dá)量。對(duì)家蠶幼蟲進(jìn)行限食與饑餓處理后，絲腺中InR基因的表達(dá)量上調(diào)，而已有研究表明饑餓使家蠶素滴度降低，推測(cè)限食與饑餓處理后絲腺對(duì)胰島素信號(hào)的敏感性顯著增強(qiáng)，但饑餓處理后增強(qiáng)的程度比限食處理更顯著。絲腺中Foxo基因的表達(dá)量在限食與饑餓處理后顯著上調(diào)，雖然絲腺中胰島素信號(hào)敏感性增強(qiáng)，但Ywhaz基因表達(dá)量下調(diào)，推測(cè)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏能上調(diào)絲腺中Foxo基因的表達(dá)量，可能導(dǎo)致FO

11、XO的活性加強(qiáng)，且營(yíng)養(yǎng)因子缺乏程度越大，F(xiàn)OXO的活性就越強(qiáng)，活化的FOXO進(jìn)而可能參與了家蠶絲腺退化消亡過(guò)程。
　　 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，饑餓能誘導(dǎo)BmN細(xì)胞自噬和凋亡的發(fā)生。而在此過(guò)程中，F(xiàn)oxo基因的表達(dá)量上調(diào)，雖然InR基因表達(dá)量上調(diào)導(dǎo)致胰島素信號(hào)敏感性增強(qiáng)，但抑制磷酸化進(jìn)程的PTEN基因的表達(dá)量提前于InR基因并大幅上調(diào)，暗示磷酸化水平被較大程度的抑制。Saposin-like的表達(dá)量在Foxo基因的表達(dá)量上調(diào)之后也大幅

12、上調(diào)，因此推測(cè)饑餓處理后，BmN細(xì)胞中FOXO的活性增強(qiáng)，且FOXO與細(xì)胞凋亡的發(fā)生聯(lián)系密切，F(xiàn)OXO參與了饑餓誘導(dǎo)的PCD過(guò)程。
　　 5.干涉家蠶Foxo基因研究結(jié)果
　　 根據(jù)調(diào)查得到的干涉組與對(duì)照組注射處理24h、48h、72h后的絲腺組織中Foxo基因的表達(dá)譜，可以確定設(shè)計(jì)的3對(duì)siRNA片段：siRNA_490、siRNA_821和siRNA_1161對(duì)Foxo基因均有干涉效果，而其中siRNA_821的干涉

13、效果最顯著，最有效。通過(guò)分析干涉組與對(duì)照組絲腺組織中Foxo、Atg8與Saposin-like基因的表達(dá)譜，推測(cè)FOXO與自噬的聯(lián)系較為緊密，且FOXO表達(dá)量的瞬時(shí)上調(diào)能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。絲腺細(xì)胞核染色及DNA電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)oxo基因干涉后，家蠶絲腺細(xì)胞的凋亡過(guò)程延后，這一結(jié)果證實(shí)了FOXO的確參與了蛻皮激素誘導(dǎo)的PCD過(guò)程；然而干涉Foxo基因后家蠶個(gè)體的表型和化蛹結(jié)繭都沒有出現(xiàn)明顯的異常現(xiàn)象，說(shuō)明干涉程度并沒有達(dá)到顯著降低該基

14、因發(fā)揮基礎(chǔ)生物學(xué)功能的表達(dá)量的要求，只是延緩了絲腺細(xì)胞PCD的過(guò)程。
　　 6.家蠶細(xì)胞死亡早期自噬與凋亡的關(guān)系
　　 本研究發(fā)現(xiàn)，在個(gè)體水平上，無(wú)論正常發(fā)育還是蛻皮激素處理后，Atg8基因的表達(dá)量上調(diào)時(shí)期均在Saposin-like之前，暗示自噬發(fā)生于細(xì)胞凋亡之前，這與已有的形態(tài)學(xué)研究結(jié)論一致；在細(xì)胞水平上，在蛻皮激素或饑餓處理后，對(duì)BmN細(xì)胞染色觀察發(fā)現(xiàn)自噬現(xiàn)象均優(yōu)先于凋亡發(fā)生，同時(shí)在饑餓處理后，Atg8基因的表達(dá)量