程序性細(xì)胞死亡與沉香倍半萜次生代謝關(guān)系的探索研究.pdf

1、國產(chǎn)沉香為瑞香科白木香Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg含樹脂的木材，為著名的芳香南藥，同時在香料、化工、宗教、工藝品等有廣泛應(yīng)用。白木香野生資源主要分布于海南、廣東、廣西、云南、福建等地。因伐樹結(jié)香，目前白木香的野生資源幾乎破壞殆盡，1999年被列為國家二級保護(hù)植物，2000年被列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟受威脅植物紅色名錄》，2004年已被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)附錄Ⅱ。目前中國已種植的

2、白木香林超過3000萬株，迫切需要高效的結(jié)香技術(shù)。近年來，魏建和團(tuán)隊發(fā)明的“通體結(jié)香”技術(shù)已開始在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用，并獲得了較好的結(jié)香效果。傷害誘導(dǎo)白木香防御反應(yīng)形成沉香的機(jī)制已得到初步揭示，但沉香形成的機(jī)制，特別是初始傷害后沉香持續(xù)形成的分子機(jī)制尚未清晰闡明，制約了通體結(jié)香技術(shù)的改進(jìn)及更優(yōu)方法的發(fā)明。本論文首次較系統(tǒng)地研究了程序性細(xì)胞死亡(PCD，programmed cell death)與沉香倍半萜形成的關(guān)系，以探索PCD與沉香形成

3、，特別是持續(xù)結(jié)香的關(guān)系。
　　1、構(gòu)建了體系均一穩(wěn)定、細(xì)胞活力良好的白木香懸浮細(xì)胞體系，健康體系未檢測到倍半萜α-愈創(chuàng)木烯(α-guaiene)、α-蛇麻烯(α-humulene)和δ-愈創(chuàng)木烯(δ-guaiene)，但MeJA可誘導(dǎo)其產(chǎn)生倍半萜，表明懸浮細(xì)胞體系可作為結(jié)香機(jī)制研究的離體材料。采用莖尖誘導(dǎo)愈傷組織，最適培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-1 NAA+1.0mg·L-16-BA;經(jīng)12次繼代培養(yǎng)的愈傷組織生長旺盛、質(zhì)地疏

4、松適于懸浮培養(yǎng);將其置于液體培養(yǎng)基MS+2.0 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-16-BA+500.0 mg·L-1 CH中震蕩培養(yǎng)，建成懸浮細(xì)胞體系。懸浮細(xì)胞生長曲線呈S型，初期增長緩慢，4-6 d為對數(shù)增長期，7-12d進(jìn)入平臺期，12d以后細(xì)胞生長速度及活力下降;GC-MS分析結(jié)果顯示，培養(yǎng)0d、3d、6d、12d懸浮細(xì)胞未檢測到倍半萜α-guaiene、α-humulene、δ-guaiene，使用100μM MeJA處

5、理24 h可明顯檢測到這三種倍半萜。PCD檢測結(jié)果表明，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)到24 d后發(fā)生PCD;熒光定量PCR檢測倍半萜誘導(dǎo)結(jié)果表明，懸浮培養(yǎng)到24 d后倍半萜合成相關(guān)基因表達(dá)明顯提高，說明生長后期的懸浮細(xì)胞不可用于結(jié)香機(jī)制研究。因此，本實驗所構(gòu)建的白木香懸浮細(xì)胞體系在7-12d可作為研究傷害誘導(dǎo)白木香防御反應(yīng)形成沉香機(jī)制的離體材料。
　　2、首次克隆了沉香倍半萜合成途徑的AsAACT、 AsHMGS、AsHDR及AsDXR4個基因全

6、長，為檢測倍半萜合成提供參考指標(biāo)。本課題對沉香倍半萜合成的4個關(guān)鍵酶基因AsAACT、AsHMGS、AsDXR、AsHDR進(jìn)行全長克隆、生物信息學(xué)分析。運用熒光定量PCR對茉莉酸甲酯MeJA及水楊酸SA誘導(dǎo)白木香懸浮細(xì)胞的關(guān)鍵基因AsAACT、AsHMGS、AsHMGR、AsDXS、AsDXR、AsHDR、AsFPS、ASS1及ASS2表達(dá)進(jìn)行分析，運用基因表達(dá)譜對火烙法、接菌法與輸液法處理的白木香轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，最終篩選到AsAA

7、CT、AsFPS、ASS1、ASS2為特異表達(dá)基因，可作為后續(xù)實驗檢測誘導(dǎo)型倍半萜的參考指標(biāo)。
　　3、H2O2脅迫可以明顯誘導(dǎo)白木香懸浮細(xì)胞PCD，生成少量的α-guaiene、α-humulene、δ-guaiene。H2O2處理后3h發(fā)生PCD，6-12h出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核皺縮及DNA降解，24 h MCP1、MCP2、Cyt-c表達(dá)明顯調(diào)高，48 h細(xì)胞核變?yōu)楹诵◇w;采用GC-MS檢測、峰面積歸一化法計算，得出三種倍半萜的相

8、對百分含量，H2O2處理后3h僅檢測到0.058％α-humulene，6 hFPS、ASS1、ASS2表達(dá)明顯上調(diào)，12h可檢測到0.244％α-humulene與0.521％δ-guaiene，24 h可檢測到0.157％α-guaiene、0.373％α-humulene、1.297％δ-guaiene。
　　4、MeJA也可以明顯誘導(dǎo)白木香懸浮細(xì)胞發(fā)生PCD，生成較大量的α-guaiene、α-humulene、δ-gua

9、iene。(1)采用2.5μM～25μM MeJA處理懸浮細(xì)胞，96 h內(nèi)細(xì)胞死亡率無明顯變化，但采用TUNEL法可檢測到陽性細(xì)胞，說明懸浮細(xì)胞發(fā)生了PCD但尚未死亡;MeJA處理后12h，三種倍半萜總量最高，2.5μM和25μM MeJA處理分別達(dá)86.098％、71.825％，之后倍半萜量下降，48 h分別下降到31.993％、20.908％;(2)采用50μM～100μM MeJA處理，12h～96h細(xì)胞死亡率顯著升高，TUNEL

10、檢測處理后懸浮細(xì)胞3h～6h呈弱陽性、24 h～96 h呈陽性;三種倍半萜總量在12 h～24 h最高，50μM和100μM MeJA處理分別達(dá)93.884％、89.037％，之后總量一直保持在71％以上;(3)采用250μM～500μM MeJA處理，在12 h～96 h細(xì)胞死亡率顯著升高，TUNEL檢測處理后懸浮細(xì)胞3h呈弱陽性、96 h呈陽性;三種倍半萜總量在24 h最高，250μM和500μM MeJA處理分別達(dá)90.197％、

11、76.335％，之后總量一直保持在58％以上;(4)相關(guān)性分析表明，細(xì)胞死亡率與倍半萜濃度呈顯著正相關(guān)，說明MeJA處理后懸浮細(xì)胞發(fā)生的PCD很可能由倍半萜誘導(dǎo);(5)Caspase抑制劑Z-VAD-FMK可一定程度減緩懸浮細(xì)胞發(fā)生PCD的進(jìn)程，但不能阻止，對倍半萜合成關(guān)鍵基因有下調(diào)趨勢，反向證明PCD對倍半萜具有正向促進(jìn)作用。
　　5、愈創(chuàng)木烯型倍半萜guaiene及α-humulene能誘導(dǎo)白木香懸浮細(xì)胞的PCD，說明初始傷害

12、后誘導(dǎo)白木香懸浮細(xì)胞生成的倍半萜可能會產(chǎn)生類似二次傷害的作用，進(jìn)一步推動PCD的發(fā)生。guaiene、α-humulene處理健康的白木香懸浮細(xì)胞，可檢測到PCD，guaiene比α-humulene更容易誘導(dǎo)PCD;隨著倍半萜濃度增加、處理時間延長，細(xì)胞死亡率升高，TUNEL的熒光強(qiáng)度增大、PCD關(guān)鍵基因的表達(dá)上調(diào)。
　　本研究采用白木香懸浮細(xì)胞體系探索了程序性細(xì)胞死亡與沉香倍半萜的關(guān)系。通過研究初步闡明傷害脅迫H2O2及MeJ