家蠶細胞及絲腺退化和凋亡的程序性細胞信號通路中 BmDredd基因的功能.pdf

1、家蠶是一種重要的經(jīng)濟動物和模式昆蟲，絲腺是家蠶非常重要的吐絲器官，直接決定著家蠶產(chǎn)絲量的多少。在家蠶由幼蟲到蛹的變型期，絲腺器官發(fā)生了劇烈的退化，在短時間內(nèi)消亡，這一過程涉及到了細胞凋亡。目前，細胞凋亡分子調(diào)控機制在哺乳動物中研究的較為清楚，但對于家蠶中的凋亡分子機制知之甚少。Dredd為caspase家族同源蛋白，本研究克隆到了家蠶BmDredd基因，并分別在細胞水平和絲腺組織水平揭示了其功能，調(diào)查了其與相關(guān)凋亡蛋白BmFadd的互作

2、關(guān)系。同時，利用高通量測序技術(shù)，進行了家蠶五齡第3天和吐絲36h后部絲腺mRNA、lncRNA與miRNA的差異表達分析，并對差異表達lncRNAs與miRNAs的靶基因做了GO功能預(yù)測。分析了BmDredd與lncRNA、miRNA的互作網(wǎng)絡(luò)。對這些內(nèi)容的探索使得家蠶細胞及絲腺凋亡的分子調(diào)控機制研究更為完善，主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1)克隆到了BmDredd基因，并且對其生物學(xué)信息進行了分析，其ORF全長1632bp，編碼

3、543個氨基酸，分子量大小約為63KDa，含有N端的long prodomain和C端的CASc domain。
　　2)在細胞水平進行BmDredd的功能研究:對BmN細胞進行了誘導(dǎo)凋亡、dsRNA干擾處理。我們發(fā)現(xiàn)凋亡的細胞中BmDredd表達量升高，而RNA干擾BmDredd的表達則可以減小細胞凋亡率，提高正常細胞數(shù)量。另外，我們構(gòu)建了BmDredd的N端、C端融合表達載體以及ORF序列過表達載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達BmDred

4、d可以引起細胞凋亡，細胞凋亡時，BmDredd由細胞質(zhì)遷移到細胞核中，其核定位片段既不是獨立的N端long prodomain序列，也不是C端CASc序列，推測定位序列位于376-987bp之間。dsRNA干擾凋亡相關(guān)基因后實時定量檢測其他基因表達量結(jié)果顯示，BmDredd與BmDaxx，BmCide-b，BmFadd,BmCreb之間存在著復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，他們一起參與調(diào)控細胞凋亡的執(zhí)行。
　　3)絲腺水平的BmDredd功能研究

5、:我們檢測了不同時期家蠶絲腺中BmDredd表達量以及家蠶不同組織在吐絲18h時BmDredd表達量，發(fā)現(xiàn)絲腺凋亡期間，BmDredd表達量升高，表明BmDredd與絲腺凋亡有著極重要的聯(lián)系。并且，在蛻皮激素飼喂家蠶后，BmDredd表達量升高，說明BmDredd屬于蛻皮激素下游靶基因。Caspase抑制劑處理絲腺可以降低BmDredd表達量，注射dsRNA-BmDredd到家蠶絲腺可以延遲絲腺凋亡，在絲腺中過表達BmDredd引起過表

6、達部位caspase-3活性的升高，所有結(jié)果都顯示BmDredd參與和誘導(dǎo)絲腺凋亡。
　　4)Fadd屬于Fas結(jié)合蛋白，在哺乳動物中可以與procaspase-8結(jié)合形成DISC(Death-inducing signalling complex)，引起細胞死亡。本實驗我們純化到了含GST標(biāo)簽的BmFadd蛋白，通過與凋亡細胞胞質(zhì)總蛋白孵育，清洗和洗脫后質(zhì)譜檢測，發(fā)現(xiàn)凋亡時BmFadd并沒有與BmDredd蛋白發(fā)生互作。

7、　　5)使用二代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)被歸到Death相關(guān)功能下的mRNAs在表達量上都沒有顯示出顯著性變化，這從側(cè)面反應(yīng)了lncRNA和miRNA在絲腺凋亡發(fā)生期間對mRNA的調(diào)節(jié)可能十分重要。共鑒定到家蠶中10947個lncRNAs，預(yù)測到索引號為TCONS_00023629、TCONS_35829、TCONS_28940、TCONS_28943、TCONS_30941的lncRNAs參與了凋亡過程。另外有344個miRNAs靶向調(diào)節(jié)著285