西米特酸抑制PI3K-AKT信號(hào)通路及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性死亡（PCD）的研究.pdf

1、一、西米特酸誘導(dǎo)人早幼粒細(xì)胞白血病HL-60凋亡的研究 1．西米特酸對(duì)HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用黃色的MTT可以被活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶代謝為藍(lán)紫色的甲瓚產(chǎn)物，并且其生成量與存活的細(xì)胞數(shù)成正比，經(jīng)DMSO溶解后呈紫色或淡紫色，根據(jù)顏色的深淺可判斷活細(xì)胞的多少。 2．西米特酸誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡 2.1形態(tài)學(xué)改變 1μg/ml西米特酸處理HL-60細(xì)胞36h后，Hoechst33258染色可見(jiàn)染色質(zhì)濃集，并可見(jiàn)

2、凋亡小體，而對(duì)照組無(wú)染色質(zhì)的濃集和凋亡小體的產(chǎn)生，這從形態(tài)學(xué)上說(shuō)明西米特酸誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生了凋亡。 2.2 DNA非隨機(jī)性降解DNA非隨機(jī)性降解是細(xì)胞凋亡的重要生物化學(xué)標(biāo)志 2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期是指一個(gè)連續(xù)分裂的細(xì)胞從一次分裂完成開(kāi)始，到下一次分裂完成為止所經(jīng)歷的全過(guò)程，可分為G<,0>期、G<,1>期、S期、G<,2>期、M期。腫瘤的一個(gè)基本特征是細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞的失控性生長(zhǎng)。 2

3、.4西米特酸處理HL-60細(xì)胞后，capase-3被活化并剪切其下游的PARP，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 2.5 Western blot結(jié)果同樣顯示，DEVD-CHO可阻斷了西米特酸誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞PARP斷裂帶的產(chǎn)生，表明西米特酸誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞的凋亡依賴于caspase-3的功能。 3．西米特酸誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的機(jī)制 3.1西米特酸對(duì)周期調(diào)控蛋白p16、p27的影響 p16和p27基因是參與調(diào)控腫瘤細(xì)

4、胞周期重要的抑癌基因，其表達(dá)水平低下或缺失，可導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)，引起腫瘤發(fā)生，而在藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡時(shí)常有p16和p27的重新激活。 3.2西米特酸對(duì)HL-60細(xì)胞c-myc的影響 c-myc是一種原癌基因，在調(diào)節(jié)DNA合成、細(xì)胞凋亡、分化及細(xì)胞周期的進(jìn)行中起重要作用。在許多腫瘤中，該基因是決定細(xì)胞從G<,0>/G<,1>期進(jìn)入S期的開(kāi)關(guān)。c-myc蛋白是一種螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸的拉鏈蛋白，在細(xì)胞由正常轉(zhuǎn)向腫瘤性生長(zhǎng)過(guò)程中起到

5、了至關(guān)重要的作用，其過(guò)度表達(dá)可使細(xì)胞無(wú)限增殖，獲永生化功能，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。 3.3西米特酸對(duì)HL-60細(xì)胞PI3K磷酸化水平的影響 PI3K信號(hào)途徑的異常激活在腫瘤中起著重要的作用。結(jié)果顯示，PI3K的總量不變化，而其磷酸化水平則逐漸降低。 3.4西米特酸對(duì)HL-60細(xì)胞AKT磷酸化水平的影響 Akt是PI3K下游最重要的信號(hào)分子，磷酸化的Akt可以激活下游靶分子，進(jìn)而發(fā)揮其細(xì)胞生存和抗凋亡作用。結(jié)果顯示，Akt的總

6、量無(wú)變化，而Akt的磷酸化水平則隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，這與其上游分子PI3K的磷酸化水平改變趨勢(shì)基本相同。 4．西米特酸誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡其他可能的機(jī)制為進(jìn)一步闡明西米特酸誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的機(jī)制，結(jié)果顯示1μg/ml西米特酸處理HL-60細(xì)胞24h和4 8h后p73、JunD、GADD45A、PPP1R15A、TNFAIP3等多種基因表達(dá)升高，MAP2K5、IGF2R等多種基因表達(dá)降低。為驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果，我們用R

7、T-PCR法檢測(cè)了部分基因的mRNA的改變情況。如圖所示，1μg/ml西米特酸處理HL-60細(xì)胞24h和48h后p73、JunD、GADD45A、PP1R15A、TNFAIP3的mRNA表達(dá)增高，而MAP2K5、IGF2R的mRNA表達(dá)水平則降低，這個(gè)結(jié)果與基因芯片的結(jié)果相吻合。有研究證明，p73可轉(zhuǎn)錄激活p53應(yīng)答基因，引起細(xì)胞周期抑制、分化和誘發(fā)細(xì)胞凋亡，Gong等的研究表明，p73可不依賴于p53功能、被非受體酪氨酸激酶通過(guò)ATM

8、磷酸化進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞周期抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，我們進(jìn)一步檢測(cè)西米特酸誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，p73蛋白水平是否改變。Western blot結(jié)果顯示，1μg/ml西米特酸處理HL-60細(xì)胞后，P73蛋白水平均比對(duì)照組高，表明p73蛋白可能參與西米特酸誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡過(guò)程。 二、西米特酸誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡的研究 1、西米特酸對(duì)Hep3B細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用首先，我們用MTT法檢測(cè)了西米特酸對(duì)Hep3

9、B細(xì)胞增殖的影響。以0.125、0.25、0.5、1和2μg/ml西米特酸處理Hep3B細(xì)胞72h，對(duì)Hep3B細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為10.4﹪、12.4﹪、 23.3﹪、89.1﹪和96.6﹪，與對(duì)照組相比，該藥能明顯抑制Hep3B細(xì)胞的增殖(P<0.05)，并呈濃度依賴性，其IC<,50>為0.57μg/ml。這說(shuō)明西米特酸在體外能顯著抑制Hep3B細(xì)胞的增殖。 2、西米特酸對(duì)Hep3B細(xì)胞caspase-3和PARP的影響

10、上文已證明西米特酸對(duì)Hep3B細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用。但是否可誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞凋亡尚不清楚。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep3B細(xì)胞，以1μg/ml西米特酸處理Hep3B細(xì)胞6h，12h，24h，36h，48h后，caspase-3和PARP蛋白并無(wú)明顯改變，也無(wú)凋亡時(shí)典型的斷裂帶的產(chǎn)生，表明，西米特酸誘導(dǎo)Hep3B死亡不是通過(guò)細(xì)胞凋亡方式實(shí)現(xiàn)，可能是通過(guò)其他的細(xì)胞死亡方式。 3、西米特酸誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡 3.1 丫

11、啶橙(Acridine orange)染色上文已排除西米特酸誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞為非凋亡性死亡。Aridine orange(AO)是可以染色細(xì)胞內(nèi)的酸性小體，如溶酶體等。細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，因溶酶體參與形成自噬溶酶體，致使pH值升高，胞內(nèi)的酸性小體減少，因此AO染色可作為一種自噬的指示劑。我們以1μg/ml西米特酸處理Hep3B細(xì)胞36h后，以AO染色，結(jié)果表明，在西米特酸處理Hep3B細(xì)胞36h后，酸性小體(紅色)比對(duì)照組明顯減少，細(xì)胞呈

12、現(xiàn)圓形、胞漿淡綠色改變，表明溶酶體等酸性小體減少、酸性被中和，提示自噬可能是西米特酸誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞死亡的方式。 3.2 Monodansylcadaverine染色 Monodansylcadaverine(MDC)是細(xì)胞自噬特異性的染色劑，在紫外激發(fā)下，自噬小體呈現(xiàn)藍(lán)色。1μg/ml西米特酸處理Hep3B細(xì)胞36h后，以MDC染色10min，激光共聚焦顯微鏡下紫外光激發(fā)，結(jié)果顯示，在西米特酸處理Hep3B細(xì)胞36h后，細(xì)胞

13、內(nèi)出現(xiàn)明顯的藍(lán)色小體，表明西米特酸誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞死亡是一種自噬性細(xì)胞死亡。 3.3西米特酸對(duì)LC3-Ⅱ的影響 LC3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母Atg8基因的同源物，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，是細(xì)胞自噬泡膜的通用標(biāo)記物。細(xì)胞中新合成的LC3經(jīng)過(guò)加工，成為胞漿可溶性LC3-Ⅰ，后者經(jīng)泛素樣加工修飾過(guò)程，與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合，形成LC3-Ⅱ，其含量的多少反映了細(xì)胞的自噬活性。 4、西米特酸誘導(dǎo)Hep3B自

14、噬的機(jī)制 4.1 西米特酸對(duì)PI3K磷酸化水平的影響 Hep3B細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)途徑被異常激活，有研究表明，細(xì)胞自噬過(guò)程中常有PI3K/AKT信號(hào)通路的參與。為檢測(cè)西米特酸誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞自噬過(guò)程中PI3K途徑是否受影響，我們用1μg/ml的西米特酸處理Hep3B細(xì)胞6h、12h、24h、36h、48h等不同時(shí)間后，Western blot方法檢測(cè)PI3K的磷酸化水平。結(jié)果顯示，PI3K的總量不變化，而其磷酸化水平則

15、逐漸降低。表明西米特酸誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞自噬過(guò)程中有PI3K的抑制。 4.2 西米特酸對(duì)Akt磷酸化水平的影響上文已證實(shí)西米特酸誘導(dǎo)Hep3B自噬性死亡時(shí)磷酸化PI3K水平逐漸降低，我們進(jìn)一步檢測(cè)PI3K下游分子Akt是否發(fā)生改變。用1μg/ml的西米特酸處理Hep3B細(xì)胞6h、12h、24h、36h、48h后，Western blot檢測(cè)顯示，隨時(shí)間的推移Akt磷酸化水平逐漸降低，而Akt總量無(wú)改變，表明Akt可能參與了西米特

16、酸誘導(dǎo)Hep3B發(fā)生自噬性死亡的過(guò)程，并且其變化趨勢(shì)與磷酸化的PI3K的變化一致。 4.3西米特酸對(duì)FKHR和mTOR磷酸化水平的影響 FKHR和mTOR是Akt下游重要的分子，活化的AKT通過(guò)磷酸化多個(gè)靶蛋白使它們失活傳遞存活信號(hào)，失活轉(zhuǎn)錄因子FKHR，磷酸化mTOR使得細(xì)胞存活、增殖等。mTOR激酶是氨基酸、ATP和激素的感受器，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有重要調(diào)節(jié)作用，也是自噬的負(fù)調(diào)控分子，通過(guò)抑制mTOR的活性，可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。在以

17、1 μ g/ml的西米特酸處理Hep3B細(xì)胞6h、12h、24h、36h、48h后，Western blot檢測(cè)顯示，F(xiàn)KHR和mTOR的磷酸化水平均逐漸減少，表明FKHR和mTOR可能參與了西米特酸誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞自噬性死亡的過(guò)程。 5、西米特酸誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞自噬的其它機(jī)制為探討西米特酸誘導(dǎo)Hep3B自噬是否有其它通路參與，我們研究了Hep3B對(duì)STAT通路的影響。正常細(xì)胞中STAT信號(hào)通路被激活是瞬時(shí)的過(guò)程，而在許多腫