家蠶蛻皮激素受體和超氣門蛋白基因的啟動子分析.pdf

1、20-羥基蛻皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)在昆蟲的蛻皮和變態(tài)期間扮演著重要的角色,包括形態(tài)發(fā)生,細胞凋亡,繁殖和行為反應等過程。蛻皮激素受體(ecdysone receptor, EcR)和超氣門蛋白(ultraspiracle, USP)是核受體超家族的成員,是20E的分子靶標。因此研究家蠶EcR和USP基因在蛻皮激素誘導下的表達調(diào)控具有一定的理論意義。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴構建FHNLuc-A3RL

2、雙熒光質粒,其中螢火蟲熒光素酶(FLuc)基因由 BmEcR和BmUSP基因不同長度的啟動子片段啟動,另一個由家蠶actin3啟動子啟動的海腎熒光素酶(RLuc)作內(nèi)參基因。通過Bac-to-Bac系統(tǒng)制備重組桿狀病毒,將這些重組病毒分別注射五齡家蠶,測定組織中各啟動子片段的熒光素酶活性。結果表明:無論在正常條件還是20E誘導下,BmEcR-A,BmEcR-B1和BmUSP基因各啟動子片段在脂肪體中的活性較高,而在中腸和馬氏管中的活性較

3、低。在BmEcR-A啟動子中,-637~-518 bp和-278~-177 bp之間為重要的調(diào)控區(qū)域;而在BmEcR-B1啟動子中-325~-198 bp之間為重要調(diào)控區(qū)域;在BmUSP啟動子中,-485~-374 bp之間為重要的正調(diào)控啟動子區(qū),而在-374~-281 bp之間為負調(diào)控因子結合的序列。
　?、茖mEcR-A的重要啟動子區(qū)進行功能分析,構建不同長度順次缺失以及重要區(qū)域突變的pGL3-Basic重組質粒,與內(nèi)參載體

4、pRL-TK共轉染BmN細胞。結果表明:在BmN細胞內(nèi)它們的啟動子活性都能被蛻皮激素誘導。EcR-A啟動子轉錄起始位點上游-637~-612 bp之間為核心啟動子區(qū),但是刪除-197~-177 bp序列后其啟動子活性明顯增加了,說明在該區(qū)域存在有抑制因子結合位點。生物信息學分析表明-637~-612 bp之間存在HSF轉錄因子的結合位點,而在-197~-177 bp之間則沒有預測到轉錄因子結合位點。
　?、欠治?197~-177

5、bp之間與之結合的轉錄因子,利用鏈親和素瓊脂糖樹脂技術,通過設計生物素標記的探針,與家蠶脂肪體核蛋白抽提物孵育,洗脫,純化后進行蛋白質SDS-PAGE電泳分析并利用質譜技術鑒定,結果顯示,在-197~-177 bp之間可能結合有家蠶轉酮醇酶蛋白。
　　⑷對BmEcR-B1和BmUSP的重要啟動子區(qū)進行功能分析,構建不同長度順次缺失的pGL3-Basic重組質粒,與內(nèi)參載體pRL-TK共轉染BmN細胞。結果表明:在EcR-B1啟動子

6、中-325~-295 bp之間包含重要的調(diào)控因子對于EcR-B1基因啟動子的轉錄調(diào)控是必要的。序列分析這一區(qū)域顯示包含有Dfd和HSF轉錄因子的結合位點;在BmUSP啟動子中,-485~-445 bp之間含有正調(diào)控因子結合位點,而在-307~-281 bp之間認為可能含有抑制因子結合位點,分別對其生物信息學分析顯示含有AP-1和Dfd轉錄因子的結合位點。
　　⑸通過檢測家蠶BmEcR和BmUSP基因啟動子在家蠶組織中的螢光素酶活性