家蠶GMC氧化還原酶家族的鑒定和注釋及蛻皮激素3位異構(gòu)化途徑相關(guān)基因的功能分析.pdf

1、GMC氧化還原酶家族(Glucose-Methanol-Cholineoxidoreductasefamily)是生物體內(nèi)眾多氧化還原酶類的一種。該酶家族成員廣泛地分布于多種生物體中，在生物體發(fā)育及代謝過程中發(fā)揮著重要的作用，如參與葡萄糖和膽堿代謝等。GMC氧化還原酶家族在昆蟲基因組中是一個較大的家族，并且在不同昆蟲中具有一定的保守性。盡管如此，昆蟲中GMC氧化還原酶的功能研究仍然較少。本研究以家蠶為模式，研究了家蠶GMC氧化還原酶的進(jìn)

2、化歷程和表達(dá)特征，并探究了GMC基因在家蠶抵抗病原微生物過程中的作用。蛻皮激素氧化酶(EcdysoneOxidase，EO)屬于GMC氧化還原酶家族，是蛻皮激素3位異構(gòu)化途徑上的限速酶。蛻皮激素3位異構(gòu)化途徑在很多昆蟲，尤其是鱗翅目昆蟲體內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)。蛻皮激素的代謝對于保持昆蟲體內(nèi)蛻皮激素正確的滴度變化致關(guān)重要。蛻皮激素3位異構(gòu)化途徑在這個過程中究竟有多大作用還未有研究。本研究從家蠶中克隆了蛻皮激素3位異構(gòu)化途徑上的兩個關(guān)鍵基因—EO和3

3、DE-3a-reducase的候選基因。通過真核表達(dá)表達(dá)出候選蛋白，酶活測定證實了他們的活性，并通過實驗驗證了這兩個基因在家蠶食桑期和變態(tài)期的功能。所取得研究結(jié)果如下:
　　 1.家蠶基因組中GMC氧化還原酶家族的鑒定及注釋
　　 本研究在家蠶基因組中鑒定出43個GMC基因，該數(shù)目在現(xiàn)今已測基因組的昆蟲中是最多的。同其它昆蟲中相似，家蠶flotillin-2基因第二內(nèi)含子里有一個高度保守的GMC基因簇，串聯(lián)排布著15個G

4、MC基因。然而在這個保守的GMC基因簇外，家蠶GMC基因經(jīng)歷了一個大的擴(kuò)增。系統(tǒng)發(fā)生分析表明家蠶GMCβ亞家族包含22個基因，其中有18個位于保守的GMC基因簇外，我們稱之為家蠶擴(kuò)增基因(SilkwormExpansiongenes，SEs)。家蠶GMCβ亞家族成員的擴(kuò)增是導(dǎo)致家蠶GMC氧化還原酶基因數(shù)目較大的主要原因。GMCβ亞家族中有18個基因(SEs)散在地分布在基因組中，相對進(jìn)化速率分析表明SEs的進(jìn)化速率顯著快于保守的GMC基

5、因簇內(nèi)的GMCβ亞家族成員，這種快速的進(jìn)化速率暗示了它們功能的分化。
　　 2.家蠶基因組中GMC氧化還原酶基因的表達(dá)及其在免疫體系中的作用
　　 利用RT-PCR的方法分析GMC基因，尤其是GMCβ亞家族基因在家蠶組織和時期的表達(dá)。結(jié)果表明家蠶GMCβ亞家族成員在組織和時期的表達(dá)模式多有不同，即使在系統(tǒng)發(fā)生樹上聚類在一起的基因的表達(dá)模式也有差異，暗示了GMCβ亞家族成員在進(jìn)化過程中有了功能的分化。利用病原菌感染家蠶后制

6、備的基因芯片的數(shù)據(jù)，分析了家蠶GMC基因的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在病原微生物感染后，有16個GMC基因的表達(dá)上調(diào)，有意思的是在這16個基因中，有14個屬于GMCβ亞家族。進(jìn)一步的實驗證實干涉其中三個上調(diào)表達(dá)的基因（BmGMC1,BmGMC12和BmGMCβ3）能顯著降低家蠶對病原微生物的抵抗能力，說明家蠶GMCβ亞家族的擴(kuò)增和家蠶抵抗外源微生物的侵染有關(guān)。
　　 3.家蠶蛻皮激素氧化酶和3DE-3a-還原酶的鑒定
　　 利用

7、?；页嵋苟辏⊿podopteralittoralis）EO和3DE-3a-reducase基因編碼的氨基酸序列，分別在家蠶中鑒定出了這兩個基因的候選。通過RACE技術(shù)獲得了候選基因的全長序列。在畢赤酵母中異源表達(dá)兩個候選基因，我們檢測表達(dá)的蛋白分別具有EO和3DE-3a-reducase活性。表達(dá)分析表明BmEO基因只在中腸表達(dá)，蛋白質(zhì)定位于中腸杯狀細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。家蠶Bm3DE-3a-reducase基因在中腸和馬氏管中均有表達(dá)，表達(dá)的

8、蛋白位于中腸杯狀細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)及馬氏管主細(xì)胞內(nèi)。時期表達(dá)分析，這兩個基因均從家蠶5齡開始時表達(dá)，在食桑期有持續(xù)表達(dá)，并在變態(tài)期高量表達(dá)。結(jié)果表明這兩個基因的表達(dá)與蛻皮激素滴度變化是相關(guān)的。
　　 4.家蠶蛻皮激素氧化酶和3DE-3a-還原酶的功能研究
　　 家蠶BmEO和Bm3DE-3a-reducase基因在食桑期和變態(tài)期均有表達(dá)，暗示了蛻皮激素3位異構(gòu)化途徑在家蠶這兩個時期都會起作用。利用RNA干涉等實驗來證實蛻皮激素3

9、位異構(gòu)化途徑在這兩個時期的作用。在食桑期，我們發(fā)現(xiàn)家蠶會通過該途徑來降解桑葉中的植源性蛻皮激素，而當(dāng)該途徑異常時，家蠶會啟動或增強(qiáng)另一個蛻皮激素代謝途徑——cyp18a1基因參與的C26位的羥基化及氧化途徑來降解植源性蛻皮激素，說明家蠶在降解植源性蛻皮激素的過程中具有一定的冗余性。在變態(tài)期，分別降低EO和3DE-3a-reducase基因表達(dá)后，家蠶體內(nèi)蛻皮激素的滴度較高，受蛻皮激素響應(yīng)的核受體基因表達(dá)異常，并且家蠶在上蔟期和蛹期的死亡

10、率顯著升高，說明蛻皮激素3位異構(gòu)化途徑對于家蠶的變態(tài)發(fā)育是十分重要的。
　　 從本研究所得到的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)GMC氧化還原酶家族基因在進(jìn)化過程中功能產(chǎn)生了大的分化，它不僅能參與昆蟲的基礎(chǔ)生理代謝及發(fā)育過程，而且在昆蟲與植物的相關(guān)作用中也起著重要作用。GMC氧化還原酶家族在昆蟲中的拷貝數(shù)較多，而且在家蠶基因組中經(jīng)歷了爆發(fā)式擴(kuò)增，并且這種擴(kuò)增與家蠶抵抗病原微生物的感染有關(guān)。綜上所述，我們認(rèn)為GMC氧化還原酶家族在不同昆蟲的特異性擴(kuò)增