棉花肉桂酰輔酶A還原酶基因(GhCCR4)的遺傳轉(zhuǎn)化和功能分析.pdf_第1頁(yè)
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1、棉花是世界上最重要的天然纖維作物,棉花在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有十分重要的地位。近年來,克隆與棉纖維次生壁加厚發(fā)育相關(guān)的基因,從分子水平改良棉纖維品質(zhì)已成為主要研究方向。肉桂酰輔酶A還原酶(Cinnamoyl-CoA Reductase,CCR)是苯丙烷代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶,此酶可能對(duì)苯丙烷代謝途徑的碳流具有潛在的調(diào)控作用。 為了明確棉花CCR基因的基本功能和對(duì)木質(zhì)素含量的影響,我們利用已經(jīng)從棉花中克隆的木質(zhì)素生物合成的限速酶基因-

2、肉桂酰輔酶A還原酶基因(GhCCR4),構(gòu)建其瞬時(shí)表達(dá)載體,通過基因槍法轉(zhuǎn)化棉花胚珠,研究基因表達(dá)對(duì)棉纖維發(fā)育的影響。然后利用農(nóng)桿菌浸染法轉(zhuǎn)化棉花,分析了GhCCR4的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下: 1)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的pGUS-CCR4融合表達(dá)載體,使用基因槍轟擊法將其轉(zhuǎn)化棉花胚珠,確定了轉(zhuǎn)化0 DPA胚珠的最佳條件:轟擊壓力為1350 psi,轟擊距離為9 cm,轟擊次數(shù)為2次。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明,GhC

3、CR4基因在棉花纖維伸長(zhǎng)期和次生壁增厚期持續(xù)表達(dá)。不同發(fā)育時(shí)期纖維長(zhǎng)度測(cè)量結(jié)果發(fā)現(xiàn),在8d時(shí)轉(zhuǎn)GhCCR4基因纖維長(zhǎng)度和對(duì)照相比沒有明顯差別,但在27 d時(shí)纖維長(zhǎng)度明顯短于對(duì)照。纖維透射電鏡切片觀察發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)GhCCR4基因的細(xì)胞次生壁與對(duì)照相比增厚達(dá)17%。上述結(jié)果說明,GhCCR4基因在纖維細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)棉花纖維的伸長(zhǎng)起到了抑制作用并能夠使細(xì)胞壁次生壁在一定程度上增厚。 2)對(duì)棉花莖尖農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的多個(gè)因素進(jìn)行了比較,完善了

4、的農(nóng)桿菌莖尖轉(zhuǎn)化體系。在以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)化過程中,應(yīng)以2天的無菌苗莖尖作為農(nóng)桿菌的感染受體,激素的最佳配比濃度為KT0.5 mg]L、IAA0.1 mg/L,莖尖長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較好,出芽率最高;卡那霉素的最適篩選濃度為50 mg/L;扦插生根的方法能夠縮短再生植株生育周期。使用上述方法,篩選抗性轉(zhuǎn)化率達(dá)到35%以上,轉(zhuǎn)化周期縮短至2-3個(gè)月。 3)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了批量的抗性幼苗,為避免假陽(yáng)性植株的出現(xiàn),首先進(jìn)行了卡那霉素點(diǎn)涂

5、和GUS化學(xué)檢測(cè),獲得陽(yáng)性植株;以CaMV35S啟動(dòng)子和NPTII報(bào)告基因序列設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行陽(yáng)性植株P(guān)CR擴(kuò)增,PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率在30%左右。使用抗性篩選和分子檢測(cè)相結(jié)合的方法,獲得了12株轉(zhuǎn)基因棉花。同時(shí)利用半定量PCR方法進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)他們與對(duì)照之間存在較為明顯的差異,反義抑制的效率較高,抑制了CCR基因的表達(dá)。 4)改進(jìn)了提取棉花不同時(shí)期纖維的RNA的熱硼酸法。棉花GhCCR4基因在本文所檢測(cè)的組織中均有所表

6、達(dá),尤其在根,莖桿中表達(dá)量較大,說明此基因有組織表達(dá)特異性。在棉纖維不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄水平有很大變化,在纖維發(fā)育初期(0-10 DPA)表達(dá)微弱,在15,20 DPA表達(dá)量最大,在25 DPA表達(dá)量降低,說明此基因在棉纖維伸長(zhǎng)發(fā)育后期高效表達(dá)。 5)對(duì)GhCCR4基因過量表達(dá)和RNA干擾轉(zhuǎn)基因棉花苗期形態(tài)觀察、木質(zhì)素和纖維素含量檢測(cè)等方法進(jìn)行比較和分析,發(fā)現(xiàn)他們與對(duì)照之間在植株形態(tài)上存在一定的差異,木質(zhì)素含量降低,這可能的原因是

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