3-羥基丙酸循化特征酶-丙二酸單酰輔酶A還原酶的表達(dá)、純化與結(jié)晶.pdf

1、3-羥基丙酸途徑是近些年發(fā)現(xiàn)的一種新型的CO2固定方式，首先在一種嗜熱絲狀不產(chǎn)氧光合細(xì)菌（Filamentous anoxygenic phototroph簡(jiǎn)稱(chēng)FAPs）中被發(fā)現(xiàn)。本論文的實(shí)驗(yàn)材料Roseiflexus castenholzii中文名稱(chēng)光合玫瑰彎菌，是FAPs中最新發(fā)現(xiàn)的一種。3-羥基丙酸循環(huán)的特征代謝中間產(chǎn)物是3-羥基丙酸，此化合物可用于合成許多重要的化工產(chǎn)品，被認(rèn)為是最具開(kāi)發(fā)潛力的化工產(chǎn)品之一。這一循環(huán)式固碳方式中涉

2、及幾種多功能酶，其中就包括催化形成3-羥基丙酸的丙二酸單酰輔酶A還原酶(MCR)。目前已知這種酶不涉及其他的生物代謝過(guò)程，因而可以作為3-羥基丙酸循環(huán)的特征酶。對(duì)丙二酸單酰輔酶A還原酶的結(jié)構(gòu)和功能的研究不僅有助于我們揭示3-羥基丙酸的形成過(guò)程，深入對(duì)3-羥基丙酸循環(huán)固碳途徑的理解，同時(shí)也促進(jìn)人們對(duì)多功能酶催化機(jī)制的認(rèn)識(shí)。
　　本論文采用分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)方法對(duì)丙二酸單酰輔酶A還原酶展開(kāi)了如下實(shí)驗(yàn):(1)以Roseiflexus

3、 castenholzii基因組為模板，根據(jù)JGI數(shù)據(jù)庫(kù)中的丙二酸單酰輔酶A還原酶的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增目的片段后，將目的片段重組到表達(dá)載體pEASY-E1上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行異源表達(dá);(2)通過(guò)預(yù)處理、親和層析、離子交換、凝膠過(guò)濾等方法對(duì)目的蛋白MCR進(jìn)行分離純化，純化獲得的蛋白質(zhì)用抗His抗體進(jìn)行Western Blot鑒定;(3)制作MCR的兔源多克隆抗體，并用兔多抗進(jìn)行WesternBlo