3種關(guān)鍵酶對(duì)肺炎克雷伯氏菌生產(chǎn)3-羥基丙酸的作用研究.pdf

1、3-羥基丙酸（3-Hydroxypropionic acid，3-HP）作為重要的化工產(chǎn)品前體，有廣闊的市場(chǎng)前景。肺炎克雷伯氏菌含有獨(dú)特的dha調(diào)節(jié)子，能以甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)3-HP，整體代謝通路清晰，但通路中一些關(guān)鍵酶的重要作用以及酶之間的相關(guān)性仍需進(jìn)一步探究。本論文主要研究肺炎克雷伯氏菌以甘油為底物代謝途徑中的三個(gè)關(guān)鍵酶:甘油脫氫酶(DhaD)、醛脫氫酶(AIdH)和1，3-丙二醇氧化還原酶(DhaT)，對(duì)3-羥基丙酸產(chǎn)量的影響。<

2、br>　　1、甘油脫氫酶(DhaD):本研究首次證明肺炎克雷伯氏菌中dha調(diào)節(jié)子具有氧化還原平衡剛性，過(guò)表達(dá)氧化途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶:甘油脫氫酶（dhaD編碼），構(gòu)建菌體K.p(pET-PK-dhaD)。通過(guò)搖瓶發(fā)酵，初步證明加強(qiáng)氧化途徑可以同步提高還原途徑的3-HP產(chǎn)量，與野生型相比提高了60％，達(dá)到1.68 g/L。酶活測(cè)定結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)甘油脫氫酶，不僅提高了其酶活，且同時(shí)提高了還原途徑的甘油脫水酶(DhaB)的活力，證明了菌體中d

3、ha調(diào)節(jié)子存在氧化與還原途徑的平衡剛性，此結(jié)論充分說(shuō)明歧化途徑“此消彼長(zhǎng)”的概念具有局限性，傳統(tǒng)的機(jī)械性敲除旁路，太過(guò)片面;要結(jié)合菌體本身結(jié)構(gòu)的特殊性以及整體性進(jìn)行途徑改造。
　　2、醛脫氫酶(DhaS):本研究發(fā)現(xiàn)一種來(lái)自枯草芽孢桿菌中全新的醛脫氫酶，首次將其應(yīng)用到提高3-HP的產(chǎn)量中，構(gòu)建工程菌K.p(pET-PK-dhaS)。通過(guò)搖瓶發(fā)酵，初步確定該酶對(duì)提高3-HP產(chǎn)量的重要作用，產(chǎn)量提高3.9倍。經(jīng)過(guò)底物專一性和輔酶選擇性

4、的實(shí)驗(yàn)鑒定，確定該酶對(duì)3-羥基丙醛有很強(qiáng)的底物專一性且以NAD+為輔酶。并通過(guò)分子模擬對(duì)該酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，從理論上證明了該酶是以NAD+為輔酶的醛脫氫酶。之后進(jìn)行了上罐放大生產(chǎn)，3-HP達(dá)到理想產(chǎn)量，說(shuō)明該基因在放大生產(chǎn)中有明顯作用。綜上所述，探究一種全新的醛脫氫酶，要將基礎(chǔ)研究和應(yīng)用價(jià)值相結(jié)合，共同探究該酶的研究意義。
　　3、1，3-丙二醇氧化還原酶(DhaT):為了證明DhaT的重要作用，將過(guò)表達(dá)dhaT基因的工程菌K.p(