肺炎克雷伯氏菌中聚3-羥基丙酸酯生物合成途徑的構(gòu)建.pdf

1、聚3-羥基丙酸酯(Poly(3-hydroxypropionate)，P3HP)，或稱為聚3-羥基丙酸脂肪酸酯，因其能在生物體內(nèi)不受排斥，且易于降解的性能，成為了石化基塑料潛在的替代品。但這一聚酯材料在生物體內(nèi)不能自發(fā)生成，如何大量生產(chǎn)并將其應(yīng)用到工業(yè)化中的問(wèn)題誠(chéng)待解決。本研究旨在人工構(gòu)建生物代謝途徑，通過(guò)克隆基因并構(gòu)建表達(dá)載體，于微生物中異源表達(dá)酶蛋白，再經(jīng)廉價(jià)碳源進(jìn)行發(fā)酵以生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物P3HP。肺炎克雷伯氏菌生長(zhǎng)速度快，遺傳背景與大

2、腸桿菌有高度同源性，且對(duì)甘油利用率高，能自身合成P3HP代謝途徑中間體:3-羥基丙醛和3-羥基丙酸，因此可作為極佳的產(chǎn)聚酯宿主。研究主要包括如下內(nèi)容:
　　1、克隆了丙醛脫氫酶基因pduP和PHA合成酶基因phaC;替換pET-PK質(zhì)粒啟動(dòng)子，得到高效表達(dá)載體pET-tac，將其作為骨架串聯(lián)表達(dá)上述兩段基因，構(gòu)建重組載體pET-tac-pduP-phaC及重組工程菌K.p(pET-tac-pduP-phaC);以甘油為唯一碳源搖瓶

3、發(fā)酵，氣相色譜法檢測(cè)，證實(shí)目的產(chǎn)物P3HP產(chǎn)生，代謝途徑構(gòu)建成功。
　　2、為提高工程菌產(chǎn)P3HP的能力，對(duì)合成途徑中聚合步驟的酶基因phaC實(shí)施兩種優(yōu)化表達(dá)策略，分別構(gòu)建了擁有兩套閱讀框架，使串聯(lián)的基因在表達(dá)時(shí)互不影響的雙啟動(dòng)子重組菌K.p(pET-tac-pduP-tac-phaC);及調(diào)換兩段基因序列在載體中的順序以優(yōu)先表達(dá)phaC的重組菌K.p(pET-tac-phaC-pduP)。前者經(jīng)24h搖瓶培養(yǎng)，生產(chǎn)0.091g/

4、L的P3HP，較原重組菌提高近2倍;經(jīng)3L培養(yǎng)基上罐發(fā)酵48h后P3HP累積達(dá)到0.44g/L;SDS-PAGE結(jié)果有明顯條帶，證明異源基因成功表達(dá);后者經(jīng)搖瓶培養(yǎng)24h后P3HP產(chǎn)量低于原重組菌，僅0.03g/L。熒光定量PCR結(jié)果顯示，兩株優(yōu)化菌中phaC的轉(zhuǎn)錄水平均高于原重組菌，但異源表達(dá)酶蛋白還受密碼子偏好性等因素制約，實(shí)際表達(dá)量小，且外源蛋白易降解，最終導(dǎo)致P3HP產(chǎn)量低。
　　3、克隆來(lái)自大腸桿菌的丙酰輔酶A合成酶基因

5、prpE，串聯(lián)phaC共表達(dá)，得到重組載體pET-tac-phaC-prpE;在載體的Kan片段中插入氯霉素基因Cm，替換原有抗性;以高產(chǎn)3-HP的重組K.pneumoniae為宿主，構(gòu)建雙質(zhì)粒工程菌K.p(pET-tac-puuC)(pET-tac-phaC-prpE);以甘油為底物發(fā)酵，產(chǎn)生的3-HP經(jīng)丙酰-CoA合成酶和PHA合成酶催化生成P3HP;SDS-PAGE結(jié)果顯示外源蛋白均有一定程度表達(dá);氣相色譜法檢測(cè)，證實(shí)產(chǎn)物存在，P