產(chǎn)3-羥基丙酸肺炎克雷伯氏菌基因表達(dá)調(diào)控元件的研究.pdf

1、3-羥基丙酸（3-HP）作為重要的平臺(tái)化合物，有著廣闊的市場(chǎng)前景。Klebsiella pneumoniae因其較高的甘油耐受性、較強(qiáng)的甘油代謝能力、發(fā)酵周期短等特點(diǎn)成為利用甘油生物法生產(chǎn)3-HP的優(yōu)勢(shì)宿主菌。但由于可用啟動(dòng)子相對(duì)較少，且少數(shù)已知可用的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性相對(duì)較弱，造成3-HP的生產(chǎn)過(guò)程轉(zhuǎn)化率較低。本研究針對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行探索，通過(guò)構(gòu)建K.pneumoniae高效表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)K.pneumoniae甘油代謝途徑進(jìn)行改造，實(shí)現(xiàn)3-

2、HP的高產(chǎn)。
　　1、選擇K.pneumoniae中13個(gè)生長(zhǎng)代謝必需基因的啟動(dòng)子構(gòu)建組成型啟動(dòng)子庫(kù)，利用GFP報(bào)告系統(tǒng)對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行篩選，獲得了具有較高轉(zhuǎn)錄活性的組成型啟動(dòng)子Pkan，該表達(dá)系統(tǒng)無(wú)需加入誘導(dǎo)劑即可實(shí)現(xiàn)相對(duì)恒定的高效表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄活性約為K.pneumoniae常用表達(dá)系統(tǒng)pET-pk的1.7倍，且對(duì)菌體的生長(zhǎng)代謝影響較小，可用于構(gòu)建K.pneumoniae高效組成型表達(dá)系統(tǒng)。
　　2、為提高3-HP產(chǎn)量，利用P

3、kan過(guò)表達(dá)來(lái)自Escherichia coli醛脫氫酶基因aldH，構(gòu)建的重組菌可實(shí)現(xiàn)甘油到3-HP的高效轉(zhuǎn)化。重組菌的搖瓶發(fā)酵數(shù)據(jù)表明，3-HP產(chǎn)量為0.47g/L，與野生菌相比提高了89.5％，與具有相同代謝負(fù)荷的空質(zhì)粒對(duì)照菌相比增加了238％。上罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，目的產(chǎn)物的產(chǎn)量為15.28g/L，甘油轉(zhuǎn)化率達(dá)13.02％，時(shí)空產(chǎn)率為0.57g·L-1·h-1。
　　3、為提高啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，對(duì)tac啟動(dòng)子核心序列進(jìn)行串聯(lián)獲得復(fù)

4、合啟動(dòng)子。利用此表達(dá)系統(tǒng)過(guò)表達(dá)醛脫氫酶基因puuC，構(gòu)建的重組菌可實(shí)現(xiàn)3-HP的高產(chǎn)。重組菌搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明重組菌K.p(pETP3 co re-tac-puuC)、K.p(pE TP5 core-tac-puuC)的3-HP產(chǎn)量分別為2.88g/L、3.10g/L。上罐發(fā)酵結(jié)果表明，3-HP的終產(chǎn)量分別為99.8g/L，81.4g/L;甘油轉(zhuǎn)化率分別是87.7％，69.3％;時(shí)空產(chǎn)率分別為1.04g.L-1.h-1，1.36g·L-1