肺炎克雷伯菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控子CRP對(duì)allS的調(diào)控研究.pdf

1、目的：探究肺炎克雷伯菌cAMP受體蛋白(cAMP receptor protein， CRP)對(duì)基因allS的調(diào)控關(guān)系及機(jī)制。
　　方法：首先，PCR擴(kuò)增allS的啟動(dòng)子區(qū)序列，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，酶切連接入placZ15質(zhì)粒，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入肺炎克雷伯菌CCW01（缺失lacZ基因）和CCW01:△crp（缺失crp基因）中。通過(guò)測(cè)定CCW01和CCW01:△crp的β-半乳糖苷酶活性，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析數(shù)值結(jié)

2、果，確定調(diào)控子CRP對(duì)allS基因的調(diào)控關(guān)系。運(yùn)用RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄肺炎克雷伯野生株和突變株△crp RNA為cDNA后比較allS基因在野生株和突變株△crp中的表達(dá)量來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證 CRP對(duì)allS的調(diào)控關(guān)系。表達(dá)純化出有活性的His-CRP蛋白，然后經(jīng)PCR擴(kuò)增allS啟動(dòng)子區(qū)的DNA序列，通過(guò)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)確定CRP是否能結(jié)合到allS的啟動(dòng)子區(qū)，通過(guò)應(yīng)用DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)鑒定CRP在allS啟動(dòng)子區(qū)的具體結(jié)合位點(diǎn)。
　　結(jié)

3、果：lacZ報(bào)告基因融合實(shí)驗(yàn)顯示CRP對(duì)allS具有正調(diào)控作用。實(shí)時(shí)定量RT-PCR顯示突變株△crp中allS基因表達(dá)量明顯低于野生株，進(jìn)而驗(yàn)證了LacZ報(bào)告基因融合實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果的正確性。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)和DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明CRP能直接結(jié)合到allS啟動(dòng)子區(qū)的-94到-60之間的堿基序列上（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為+1）。
　　結(jié)論：CRP調(diào)控子可以結(jié)合到allS的啟動(dòng)子區(qū)并促進(jìn)allS基因的轉(zhuǎn)錄。本研究首次探索了肺炎克雷伯菌轉(zhuǎn)錄