肺炎克雷伯菌突變株Δcrp的毒力表型分析及調(diào)控子CRP對(duì)基因KP1_4563的調(diào)控.pdf

1、目的：
　　肺炎克雷伯菌CRP是一種整體調(diào)控子，調(diào)控著眾多毒力基因（菌毛、莢膜多糖、鐵攝入因子等相關(guān)基因）的轉(zhuǎn)錄。肺炎克雷伯菌基因KP1_4563編碼產(chǎn)物參與調(diào)控III型菌毛的表達(dá)，生物信息學(xué)分析提示CRP可能通過調(diào)控KP1_4563基因轉(zhuǎn)錄而影響肺炎克雷伯菌III型菌毛的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控菌株毒力。分析肺炎克雷伯菌臨床分離株WT（wild type）、突變株（Δcrp）和回補(bǔ)株（c-Δcrp）對(duì)細(xì)胞毒力和小鼠毒力的差別，進(jìn)一步研究C

2、RP對(duì)KP1_4563基因的調(diào)控，為深入研究CRP的調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)。
　　方法：
　　首先用肺炎克雷伯菌野生株、突變株和回補(bǔ)株感染A549細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)變化并計(jì)算黏附的菌量，檢測細(xì)胞LDH量反應(yīng)細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的毒性。其次，三株不同菌株感染5周齡Balb/c雌性小鼠后，觀察4周并記錄小鼠狀態(tài)及死亡情況，用LD50表示菌株毒力的大小。最后，純化CRP蛋白，與KP1_4563基因片段進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)，觀察轉(zhuǎn)錄調(diào)控子CRP對(duì)KP

3、1_4563基因啟動(dòng)子區(qū)是否有直接結(jié)合。
　　結(jié)果：
　　細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)顯示突變株對(duì)細(xì)胞的黏附菌量（logCFU=4.122）均低于野生株（logCFU=5.145）及回補(bǔ)株（logCFU=4.915）。經(jīng)過摸索，細(xì)胞活性測定實(shí)驗(yàn)，確定以MOI=1000的菌量感染A549細(xì)胞8h，反應(yīng)上清稀釋10倍為最佳反應(yīng)條件。突變株對(duì)細(xì)胞毒性百分比（19.54％）明顯低于野生株（70.69%）。小鼠經(jīng)腹腔注射菌液后，連續(xù)4周每天觀察，發(fā)現(xiàn)

4、空白對(duì)照小鼠無異常癥狀出現(xiàn)，而經(jīng)腹腔感染KP野生株WT菌后，在24小時(shí)內(nèi)可出現(xiàn)死亡，有四肢抽搐、運(yùn)動(dòng)不活潑、呼吸困難、豎毛、尾部痙攣等癥狀，回補(bǔ)株的LD50=104.5與野生株LD50=104.3接近，而突變株Δcrp的毒力（LD50=105.3）低于野生株和回補(bǔ)株。EMSA實(shí)驗(yàn)證明CRP蛋白能夠特異性形結(jié)合到KP1_4563基因的啟動(dòng)子區(qū)，有明顯的阻滯條帶，說明該基因受CRP蛋白的直接調(diào)控。
　　結(jié)論：
　　crp基因敲除