E1A激活基因阻遏子基因調控肝臟脂肪代謝表型及機制研究.pdf

1、本研究通過基因敲除和轉基因技術研究CREG調控NAFLD的表型及機制。在研究中，我們運用了分子生物學、形態(tài)學、細胞生物學等研究方法，圍繞CREG表達量與肝組織及細胞糖代謝、脂肪代謝調節(jié)關系，以及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)超家族中ASK1-JNK1細胞信號轉導通路在其中發(fā)揮的關鍵性調控作用等問題進行了探討。為CREG基因在治療代謝綜合征-NAFLD系列疾病中的應用提供

2、了可行的思路。
　　本研究課題的主要研究方法和實驗結果如下:
　　1.CREG基因表達與NAFLD相關性研究
　　首先運用分子生物學手段觀察NAFLD模型后肝臟組織和細胞中CREG表達變化。結果發(fā)現NAFLD模型肝臟組織中CREG基因的mRNA以及蛋白表達均顯著下調（HFD0.43±0.04vs NC1.00±0.21，P＜0.05vs NC;HFD2.68±1.04vs NC5.88±0.92，P＜0.05vs NC

3、)。進一步的細胞學研究發(fā)現，原代肝細胞中CREG蛋白表達量與代表細胞脂肪累積程度的棕櫚酸濃度水平呈負相關。在禁食/飽食小鼠模型研究中，禁食24小時后，脂肪代謝相關的信號蛋白PEPCK和G6Pase以及CREG蛋白的表達水平均明顯下調(P＜0.05vs feed)。上述動物模型以及細胞模型實驗表明，CREG基因及蛋白表達量與肝臟組織/細胞中脂肪累積量呈負相關關系。
　　在人體肝臟標本CREG蛋白含量檢測顯示，與正常肝臟組織相比，NA

4、FLD組CREG蛋白含量顯著下調（NAFLD1.00±0.25vs normal2.77±0.34，P＜0.05）。石蠟切片CREG免疫組化研究顯示，CREG主要分布于肝細胞胞漿，在NAFLD組切片染色中可見CREG蛋白表達有減少趨勢。
　　以上實驗表明，肝臟細胞在細胞內脂肪累積的過程中，CREG基因表達水平以及蛋白表達水平顯著下調。本部分結論為CREG基因及蛋白表達量可能與肝臟脂肪代謝水平相關。
　　2.CREG基因表達調

5、控NAFLD糖代謝、脂肪代謝表型研究
　　首先將CREG肝臟特異性條件性敲除(Conditional knockout，KO)，研究高脂飼養(yǎng)（High fat diet，HFD）情況下糖代謝表型及信號通路改變。KO后高脂飼養(yǎng)后，小鼠體重，肝重/體重，肝臟重量都顯著增加。同時，KO組葡萄糖耐量和胰島素耐量指標異常，空腹血糖和空腹胰島素水平以及HOMA-IR顯著增高。Western-blot分析顯示KO組胰島素信號通路相關分子Irs1

6、/Akt,GSK3β，FOXO1磷酸化水平均顯著下降。進一步的糖原染色顯示糖原在KO后減少。但將CREG肝臟特異性高表達(Transgenic，TG)后，上述指標變化趨勢均被翻轉。以上結果表明，CREG肝臟特異性敲除后HFD可發(fā)生糖代謝紊亂，而CREG高表達(TG)可顯著改善糖代謝。
　　進一步的CREG調控脂肪代謝研究中，腹部超聲顯示，高脂喂養(yǎng)后KO組小鼠相同觀察點肝臟厚度明顯增加（thickness:4.97±0.25mm v

7、s3.53±0.35mm，P＜0.05）。HE及油紅O染色顯示，KO顯著增加高脂飼養(yǎng)條件下肝臟脂肪累積，而TG組可逆轉高脂肪累積現象。同時，KO-HFD組中游離脂肪酸NEFA，總膽固醇，甘油三酯及肝功指標顯著上升，而TG可顯著改善上述指標。細胞學形態(tài)學實驗中原代肝細胞油紅O及脂肪特異性B ODIPY-C16熒光染色亦證明了CREG敲除后脂肪累積加重，而高表達CREG可逆轉這一趨勢。脂肪代謝相關信號通路研究中，AMPK及ACC磷酸化水平與

8、CREG表達量正相關，mTOR和p70S6K則呈負相關。接下來我們檢測了糖代謝、脂肪代謝、炎癥相關的基因表達水平，結果顯示CREG高表達后以下基因表達量上升（ABCG1，CYP7A1，PPAR-α，CPT-1a，ACOX-1，UCP2，IL-10，PDK4），同時以下基因表達量下調(HMGCR，SREBP-1C，FAS，ACCa,CD36，FATP1，FABP1，PPAR-γ，PEPCK，G6PC，IL-1b，IL-6，TNF-α，MC

9、P-1)。上述結果表明，CREG高表達可顯著改善肝臟組織細胞內的脂肪變性，并可減輕肝臟炎癥反應。
　　上述實驗證實了CREG在環(huán)境因素HFD誘發(fā)的肝臟脂肪變性的影響，同時我們也在遺傳因素導致肥胖的ob/ob小鼠中驗證了CREG對糖、脂肪代謝的調節(jié)作用。CREG蛋白表達量在ob/ob小鼠飼養(yǎng)2w，4w，8w，12w四個時間點逐漸下調。而肝臟HE及油紅O染色結果顯示CREG過表達可顯著降低脂肪累積水平。CREG高表達顯著降低血糖和血胰

10、島素水平，改善了ob/ob小鼠的糖代謝紊亂，同時下調了血脂水平。以上提示CREG高表達可改善ob/ob小鼠糖脂代謝紊亂。
　　綜合上述結果，CREG高表達可改善肝臟脂肪變性動物模型的糖代謝及脂肪代謝紊亂。
　　3.CREG基因表達調控NAFLD糖代謝、脂肪代謝分子機制研究
　　為明確CREG的具體作用機制，我們用western blotting技術同時在組織和細胞水平檢測了對肝臟脂肪變性及代謝綜合征起到關鍵作用的MAP

11、K家族分子MEK，ERK，JNK and P38磷酸化水平，結果提示，CREG基因敲除組脂肪變性后，JNK磷酸化水平上調，過表達CREG后JNK磷酸化水平下降，其他信號分子未見明顯變化。在糖、脂肪代謝表型層面，應用JNK特異性抑制劑可完全翻轉CREG敲除后的脂肪變性加重趨勢。同時，我們對人肝臟切片P-JNK和CREG免疫組化染色進行了相關性分析，結果發(fā)現二者呈現負相關關系(r=-0.8686，P＜0.05)。上述結果提示CREG調控糖脂

12、代謝的機制和JNK信號通路密切相關。
　　接下來，我們進一步分析了JNK1和JNK2兩個亞型在CREG調控糖脂代謝中的具體作用分工。CREG和JNK1（CREG-JNK1-dual knockout，CREG-JNK1-DKO）或JNK2（CREG-JNK2-dual knockout，CREG-JNK2-DKO）雙敲除小鼠的肝臟HE及油紅O染色顯示，與CREG敲除后高脂飼養(yǎng)組相比，CREG-JNK1-DKO組肝臟脂肪累積減輕，而

13、CREG-JNK2-DKO組無變化。同時，CREG-JNK1-DKO組翻轉了CREG敲除后HFD帶來的體重、肝重/體重、血糖、HOMA-IR等指標的惡化趨勢，而CREG-JNK2-DKO無變化。以上提示，CREG對糖脂代謝的調控作用主要通過JNK1通路完成。
　　為進一步研究CREG分子和JNK的作用方式，我們運用免疫共沉淀及western blotting技術驗證了肝臟脂肪變性和代謝綜合征中經典的信號通路ASK1-MKK4/7-

14、JNK與CREG的共同作用。結果提示，CREG可以直接與ASK1結合并調控其磷酸化水平。同時我們利用原代肝細胞研究了CREG于P-ASK1的變化關系，ASK1磷酸化水平隨著棕櫚酸濃度的增加而升高，CREG與ASK1磷酸化水平呈負相關趨勢。以上表明CREG通過與ASK1直接結合并調節(jié)其磷酸化水平，進而發(fā)揮其調控JNK信號通路的作用。
　　綜上所述，本課題首次發(fā)現CREG在肝臟糖代謝及脂肪代謝中的重要作用，并基本闡明了其中CREG-A

15、SK1-JNK信號通路作用機制。首先，通過動物肝臟脂肪變性及細胞脂肪變性模型觀察到細胞脂肪變性時CREG基因和蛋白表達顯著下調，發(fā)現CREG基因表達可能與肝臟脂肪代謝相關;接下來，通過基因敲除技術及轉基因動物模型控制肝細胞內CREG表達量，研究其對肝細胞糖及脂肪代謝的影響，發(fā)現CREG可以改善肝臟脂肪變性動物模型的糖代謝及脂肪代謝紊亂;最后，對CREG調控糖脂代謝的信號通路分析顯示，CREG可通過直接與ASK1結合后調節(jié)其磷酸化水平，進