納米微孔人EIA激活基因阻遏子糖蛋白洗脫支架預防再狹窄研究.pdf

1、目的：藥物洗脫支架已被證實可以有效抑制新生內(nèi)膜增殖和再狹窄的發(fā)生。然而，聚合物涂層藥物洗脫支架的高分子聚合物長期存留體內(nèi)，引起內(nèi)皮愈合延遲以及持續(xù)炎癥細胞浸潤，而這些可能導致晚期支架內(nèi)血栓形成以及晚期再狹窄等并發(fā)癥。理論上，無聚合物載體藥物洗脫支架在有效抑制新生內(nèi)膜增殖的同時，可以在一定程度上避免上述晚期不良反應的發(fā)生。研究表明E1A激活基因阻遏子是成熟生物體內(nèi)維持組織和細胞分化的重要分子，在腫瘤細胞誘導分化和抑制損傷血管VSMCs去分

2、化、促進內(nèi)皮功能恢復中均具有積極的生物學功能。本文選用本室自主研發(fā)的人E1A激活基因阻遏子糖蛋白為洗脫藥物，納米微孔支架為平臺，利用被動吸附的方法制備納米微孔人E1A激活基因阻遏子糖蛋白洗脫支架。在制備并檢測了納米微孔人E1A激活基因阻遏子糖蛋白洗脫支架體外特性的基礎(chǔ)上，應用小型豬為動物模型評價了納米微孔人E1A激活基因阻遏子糖蛋白洗脫支架的生物安全性和防治支架內(nèi)再狹窄的有效性。
　　方法：1：將人293F細胞株用Lipofect

3、amine2000轉(zhuǎn)染，篩選穩(wěn)定表達的細胞克隆，免疫應跡方法鑒定hCREG/myc-His融合蛋白的表達，糖苷酶法及Westernblotting行hCREG/myc-His融合蛋白的糖基化分析。應用Ni-NTA柱純化CREG糖蛋白，用HiTrap脫鹽柱將純化后的CREG蛋白脫鹽。2：將清洗和消毒好的納米微孔支架在37℃條件下浸泡于緩沖液稀釋至0.5mg/ml，1.0mg/ml，1.5mg/ml的CREG糖蛋白溶液中。采用125I放射性

4、標記單抗CREG蛋白的方法對CREG蛋白在支架上的吸附以及CREGES在體外藥代動力學進行了檢測。應用免疫熒光的及掃描電鏡的方法確定CREG糖蛋白在支架上的吸附。以培養(yǎng)的血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞為模型對CREG洗脫支架體外生物活性分析。3：將納米微孔裸支架、聚合物載體雷帕霉素洗脫支架以及CREG洗脫支架隨機植入21頭小型豬的前降支、回旋支和右冠脈。在植入后7天、14天和1個月復查造影，并行組織形態(tài)學測量以及病理分析。
　　結(jié)果：裂

5、解穩(wěn)定表達pcDNA3.1myc-His/hCREG的293F細胞及未轉(zhuǎn)染的對照細胞，行Westernblot檢測。hCREG抗體，myc抗體及His抗體均檢測到大小約為30KD的融合蛋白表達。為證明帶有myc和His標簽的重組hCREG蛋白為糖基化蛋白，將蛋白用PNGaseF處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hCREG融合蛋白分子量由30KD降低至25KD，電泳條帶下移。將純化后CREG糖蛋白以及收集的洗脫液經(jīng)離心超濾管濃縮后，經(jīng)BCA法測定并與蛋白標準

6、曲線比較，發(fā)現(xiàn)重組hCREG蛋白濃度為1.6mg/mL，測量純度為93％。濃縮并脫鹽后的純化蛋白經(jīng)PNGaseF處理后分子量由30KD降至25KD，證實純化后的蛋白仍保留了糖基化形式。125I放射標記單抗的方法對CREG白在支架上的吸附以及CREG蛋白在體外的釋放進行了定量的檢測。從吸附實驗的結(jié)果來看，CREG蛋白在支架上的吸附量與蛋白溶液的濃度和吸附時間有關(guān)。實驗檢測了支架在三種不同的蛋白濃度中吸附48h的實驗數(shù)據(jù)，最大的蛋白吸附量是

7、在1.5mg/ml的蛋白溶液中吸附24h時得到的。支架上蛋白的釋放時間可達到2周以上。為了研究CREGES體外生物學效應及蛋白穩(wěn)定性，直接將支架置采用性蛋入內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞的培養(yǎng)皿中，觀察其對內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞增殖的影響。結(jié)果顯示在3天和4天時與BMS相比，CREGES組內(nèi)皮細胞數(shù)明顯增高（P﹤0.05），而PARNTER組內(nèi)皮細胞數(shù)明顯減少（P﹤0.05）。在平滑肌增殖試驗研究表明CREG可以顯著抑制平滑肌細胞增殖，在4天、6天

8、及8天時與BMS相比CREGES及PARTENER支架可以明顯抑制平滑肌細胞增殖（P﹤0.05），而CREGES及PARTENER支架對平滑肌細胞增殖影響無差別。但是在10天時PARTENER支架抑制平滑肌細胞增殖程度顯著強于CREGES及BMS（P﹤0.05）。
　　在體研究結(jié)果表明CREGES具有良好的安全性，未發(fā)現(xiàn)支架內(nèi)血栓和支架周圍炎癥。3組冠狀動脈大小和血管損傷積分程度無顯著差異。4周時，3組支架均觀察到不同程度的內(nèi)膜增

9、生。4周時各組間管腔面積及中膜面積無顯著差異，但是各組間新生內(nèi)膜面積存在顯著差異（p=0.01），其中PARNTER組及CREG組新生內(nèi)膜面積較BMS組顯著減少，而PARNTER組及CREG組間新生內(nèi)膜面積無顯著差異（p=0.87）。同時，各組間管腔狹窄程度存在顯著差異（p<0.01），其中BMS組管腔狹窄程度比PARNTER組（48％±4％vs.15％±4％,p<0.01）及CREG組（48％±4％vs.20％±3％,p<0.01）明

10、顯增大，PARNTER組與CREG組間管腔狹窄程度無顯著差異（20％±4％vs.15％±3％,p=0.06）。免疫組化顯示a-SMC-actin含量及CD68陽性指數(shù)在3組之間無差別。但是，CREGES組及PARNTER組的細胞增殖標記物Ki67指數(shù)明顯高于BMS組，而CREGES組與PARNTER組Ki67指數(shù)無顯著差別。為了研究3種支架對內(nèi)皮化程度的影響，本研究進行了在不同時間點進行CD31染色并且計算了內(nèi)皮化積分。結(jié)果顯示7天時3