E1A激活基因阻遏子在小鼠胚胎發(fā)育中的表達(dá).pdf

1、目的: E1A激活基因阻遏子(CREG) 是從HeLa細(xì)胞cDNA文庫中克隆的一種新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)因子。它可直接與腺病毒E1A 蛋白和轉(zhuǎn)錄因子E2F競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶基因的啟動(dòng)子區(qū),阻遏它們對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化。CREG蛋白與6-磷酸甘露醇胰島素樣生長因子II受體相關(guān)，在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮抑制增殖和促進(jìn)分化的作用。先前本研究室應(yīng)用差異顯示PCR技術(shù)在體外培養(yǎng)的分化表型人VSMCs克隆株HITASY細(xì)胞中篩選到高表

2、達(dá)差異性CREG基因，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CREG基因表達(dá)與HITASY細(xì)胞的分化狀態(tài)密切相關(guān)，即去血清培養(yǎng)誘導(dǎo)HITASY細(xì)胞由合成表型逆轉(zhuǎn)為分化表型的過程中伴有CREG mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)。CREG可以與血清反應(yīng)因子協(xié)同作用于平滑肌α-肌動(dòng)蛋白(SM α-actin) 啟動(dòng)子區(qū)的CArG元件從而啟動(dòng)SM α-actin的表達(dá)，參與體外培養(yǎng)的大鼠原代VSMCs表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控。大鼠頸動(dòng)脈拉傷實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CREG蛋白表達(dá)與血管損傷后RS過程中

3、平滑肌細(xì)胞增殖能力呈負(fù)相關(guān)。提示CREG基因具有促進(jìn)分化、抑制增殖等使VSMCs向分化表型轉(zhuǎn)化的功能。為進(jìn)一步明確CREG表達(dá)與組織器官發(fā)育的關(guān)系, 本研究采用免疫組織化學(xué)、蛋白印跡（Western blot）及逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）等方法觀察了不同小鼠胚胎發(fā)育階段和胚胎E18.5 d時(shí)各組織中CREG的表達(dá), 以及小鼠血管發(fā)育過程中CREG的表達(dá)變化，為后續(xù)CREG的生物學(xué)功能研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:

4、1 建立小鼠胚胎模型，取不同胎齡的胎鼠制備標(biāo)本、HE 染色、形態(tài)學(xué)觀察。 2 以免疫組織化學(xué)染色方法，檢測(cè)CREG 蛋白在小鼠胚胎的表達(dá)時(shí)相及在不同臟器的表達(dá)定位。 3 Western blot 方法檢測(cè)不同發(fā)育時(shí)期小鼠胚胎CREG 表達(dá)變化及E18.5 d 胎鼠各臟器CREG 蛋白表達(dá)含量。 4 采用TRIZOL 法提取不同胎齡胎鼠總RNA，以RT-PCR法，檢測(cè)不同胎齡胎鼠CREG mRNA 的動(dòng)態(tài)表達(dá)。

5、 5 HE 染色觀察胚胎及新生、成年小鼠血管發(fā)育的形態(tài)學(xué)變化。 6 研究發(fā)育不同時(shí)期的小鼠胚胎及新生、成年小鼠血管平滑肌分化標(biāo)志蛋白SM α-actin 與CREG蛋白表達(dá)的相互關(guān)系。 7 觀察CREG 蛋白在成鼠不同臟器血管的表達(dá)變化。 結(jié)果: (1) CREG蛋白在小鼠不同胚胎發(fā)育階段的表達(dá)： CREGE5.5 d開始表達(dá)，CREG陽性細(xì)胞主要分布于原始外胚層。原腸期E6.5 d后三胚層均有CRE

6、G表達(dá)。以后隨著各組織器官的逐漸形成，CREG分布于不同組織器官，但在不同器官的表達(dá)時(shí)相并不同步。E13.5 d、E15.5 d和E18.5 d胎鼠心臟、腦、肝臟中CREG表達(dá)均為陽性，而肺、腎和小腸在E13.5 d和E15.5 d無表達(dá)，E18.5 d時(shí)各臟器表達(dá)陽性。Western blot結(jié)果顯示從E9.5 d開始，CREG表達(dá)呈明顯上升趨勢(shì)，至出生前即E18.5 d表達(dá)最高。對(duì)不同發(fā)育階段的小鼠胚胎實(shí)施RT-PCR分析顯示，E9

7、.5 d~E18.5 dCREG mRNA表達(dá)均為陽性，且表達(dá)量逐漸增高，到E18.5 d CREG mRNA表達(dá)最高，同Western blot結(jié)果相似。 (2) CREG在E18.5 d小鼠體內(nèi)的表達(dá)分布：提取E18.5 d小鼠各臟器的蛋白行Western blot分析，結(jié)果顯示, CREG在腦、心臟、肺、肝、小腸和腎等多個(gè)臟器中均有較高表達(dá)，且肺和肝臟中的表達(dá)弱于其他臟器。免疫組化觀察CREG在各臟器細(xì)胞中表達(dá)分別為腦膠質(zhì)

8、細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、小腸粘膜細(xì)胞和腎小管細(xì)胞，呈均一的深棕色顆粒物質(zhì)分布于細(xì)胞漿內(nèi), 胞核呈陰性。 (3) 小鼠胚胎血管的形態(tài)學(xué)特征及CREG表達(dá)定位：E9.5 d血管的管壁由單層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞間隙較大，腔內(nèi)可見血細(xì)胞。免疫組化結(jié)果顯示CREG表達(dá)陽性（＋＋），主要定位于血管壁單層內(nèi)皮細(xì)胞中；此時(shí)VSMCs分化標(biāo)志蛋白SM α-actin表達(dá)為陰性。胚胎發(fā)育至E10.5 d，胚胎血管壁周圍開始出現(xiàn)少量雙層或

9、多層環(huán)繞排列的管壁細(xì)胞，細(xì)胞間排列松散。免疫組化染色觀察到SM α-actin蛋白陽性表達(dá)（＋），主要定位于內(nèi)皮細(xì)胞外側(cè)的管壁細(xì)胞中。同時(shí)，CREG蛋白表達(dá)陽性（＋），定位與SMα-actin蛋白一致。E12.5 d的胚胎動(dòng)脈壁內(nèi)VSMCs環(huán)繞管腔呈不規(guī)則多層排列，細(xì)胞為多角形，與周圍間充質(zhì)細(xì)胞分界不明顯。免疫組化分析顯示VSMCs中SM α-actin蛋白表達(dá)（＋＋），較E10.5 d明顯增強(qiáng)，同時(shí)VSMCs中CREG蛋白表達(dá)（＋＋）

10、也明顯增強(qiáng)。胚胎E15.5 d至E18.5 d，隨著血管進(jìn)一步發(fā)育，血管壁內(nèi)、中、外三層膜結(jié)構(gòu)逐漸清晰，管腔增大，與周圍組織分界清楚。管壁各層細(xì)胞間排列致密，中膜VSMCs由多角形轉(zhuǎn)化為長梭形，并呈層狀排列，細(xì)胞核漿比例大。在E15.5 d胚胎血管中SMα-actin蛋白（＋＋＋）和CREG蛋白的表達(dá)（＋＋＋）均較前述各時(shí)間點(diǎn)明顯增強(qiáng)，并且CREG蛋白在血管壁內(nèi)、中和外膜三層結(jié)構(gòu)細(xì)胞中均明顯表達(dá)。但胚胎發(fā)育至E18.5 d時(shí)，SM α-

11、actin蛋白（＋＋＋）仍在VSMCs中高表達(dá)，而CREG蛋白表達(dá)則下調(diào)（＋＋）。 (4) 新生及成年小鼠主動(dòng)脈的形態(tài)學(xué)變化及CREG的表達(dá)：新生1 d小鼠主動(dòng)脈血管壁內(nèi)、中和外膜結(jié)構(gòu)清晰，管腔大且與周圍組織分界清楚。管壁各層細(xì)胞間排列緊密，VSMCs在動(dòng)脈中膜層狀排列，細(xì)胞細(xì)長呈長梭形，胞核明顯，核漿比例及平均細(xì)胞直徑較大。出生28 d后，小鼠主動(dòng)脈逐漸發(fā)育成熟與2 m齡成鼠主動(dòng)脈的形態(tài)相似，細(xì)胞外基質(zhì)增加，VSMCs被增寬的

12、彈力膜和膠原纖維分隔形成成熟的中膜層。VSMCs核漿比例進(jìn)一步縮小，細(xì)胞核近似長桿狀。出生后1 d、28 d和2 m小鼠主動(dòng)脈血管壁中SM α-actin蛋白和CREG表達(dá)均為陽性（＋＋）。 (5) 不同臟器功能血管中CREG的表達(dá)：成年小鼠心、肺、脾和腎臟標(biāo)本石蠟切片的CREG免疫組化分析顯示，上述臟器功能血管中CREG蛋白表達(dá)均為陽性，但表達(dá)強(qiáng)度不同。其中心臟冠狀動(dòng)脈的CREG蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽性（＋＋＋）。而在肺小動(dòng)脈、脾動(dòng)脈

13、和腎臟小動(dòng)脈中，CREG蛋白的表達(dá)則為弱陽性（＋），較冠狀動(dòng)脈明顯降低。 結(jié)論: 1 CREG在小鼠胚胎早期E5.5 d開始表達(dá)，持續(xù)表達(dá)至出生前，表達(dá)含量逐漸增多。CREG在胚胎各臟器發(fā)生中的表達(dá)時(shí)相不同，但E18.5d時(shí)胚胎各臟器中均可見CREG蛋白表達(dá)，其表達(dá)分布與成年小鼠各臟器的表達(dá)一致。上述結(jié)果提示，CREG可能作為胚胎發(fā)育的調(diào)控因子，在胚胎發(fā)育、分化和成熟過程中起重要作用。 2 CREG蛋白在小鼠胚胎