E1A基因阻遏子基因抑制TNF-α誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的作用與機(jī)制研究.pdf

1、目的:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells，BMSCs）可以修復(fù)缺血損傷心肌的血管再生，改善損傷區(qū)域心肌的存活能力，可是BMSCs被移植到缺血損傷的心肌部位后存活率極低的現(xiàn)象卻嚴(yán)重妨礙了其血管再生和損傷修復(fù)功能的發(fā)揮。研究發(fā)現(xiàn)：缺血心肌區(qū)域炎癥反應(yīng)所產(chǎn)生的炎性介質(zhì)是致使移植的BMSCs大面積凋亡的重要原因之一。本室前期研究證實，E1A激活基因阻遏子（Cellularrepress

2、orofE1A-stimulatedgenes，CREG）具有抑制多種細(xì)胞凋亡的生物學(xué)功能。因此，我們希望探討CREG修飾能否有效的抑制炎癥因子所誘導(dǎo)的BMSCs凋亡及其調(diào)控機(jī)制。
　　方法:1應(yīng)用原代培養(yǎng)的大鼠BMSCs為實驗細(xì)胞模型。2應(yīng)用表達(dá)CREG的腺病毒載體感染BMSCs，以制備CREG基因修飾的BMSCs，應(yīng)用Westernblot方法鑒定CREG基因在BMSCs中的表達(dá)效率。3用FITC-AnnexinV/PI雙染色

3、法和TUNEL法檢測添加20ng/mL腫瘤壞死因子-α（TNF-α）刺激10h后controlBMSCs組、normBMSCs組、GFPBMSCs組、CREGBMSCs組的BMSCs凋亡率。4Westernblot方法檢測各相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:通過FITC-AnnexinV/PI雙染色法和TUNEL法研究發(fā)現(xiàn)，Ad-CREG瞬時轉(zhuǎn)染的BMSCs可以有效抑制20ng/mLTNF-α刺激10h后誘導(dǎo)的凋亡，凋亡率明顯低于其他三

4、組并且具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，正常的BMSCs在20ng/mLTNF-α刺激15min后細(xì)胞漿核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）表達(dá)量開始減少，而NF-κB結(jié)合抑制蛋白IκB的磷酸化活化現(xiàn)象增加。normBMSCs組和GFPBMSCs組細(xì)胞胞漿蛋白NF-κB和IκB的變化與controlBMSCs組相似。與之相反，TNF-α刺激15min后，檢測CREGBMSCs組的細(xì)胞胞漿蛋白發(fā)現(xiàn)，N

5、F-κB表達(dá)未見顯著減少，磷酸化的IκB表達(dá)也未見增加。進(jìn)一步的核蛋白提取物檢測研究發(fā)現(xiàn)，normBMSCs組和GFPBMSCs組的NF-κB蛋白在TNF-α刺激15min后在核內(nèi)開始表達(dá)，而CREGBMSCs組則沒有NF-κB蛋白入核轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象發(fā)生。
　　通過NF-κB的抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）200μM與細(xì)胞共培養(yǎng)預(yù)處理進(jìn)一步證明，CREG表達(dá)抑制TNF-α誘導(dǎo)的BMSCs凋亡是通過抑制NF-κB活化和入核轉(zhuǎn)位完