TNF-α預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化治療神經(jīng)病理性疼痛的研究.pdf

1、神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic Pain，NPP)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，傳統(tǒng)的抗炎藥、鈣離子通道拮抗劑、三環(huán)類抗抑郁藥等，在NPP的治療中非常局限，這使得NPP的治療成為臨床上亟待解決的問題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs)因其獨(dú)特的生物學(xué)特點(diǎn)和優(yōu)勢如：增殖率高、遺傳穩(wěn)定、低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)作用等特點(diǎn)，而直接用于神經(jīng)病理性疼痛等疾病的治療。但BMMSCs發(fā)揮治療作用

2、的機(jī)制尚不明確。研究表明小膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia，MG)在微量促炎因子作用下即可活化，活化后的MG可釋放大量主導(dǎo)NPP發(fā)生與進(jìn)展的炎性介質(zhì)。因此，調(diào)節(jié)MG過度活化成為治療NPP的重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)MSCs可被移植微環(huán)境中的促炎因子激活，通過自身旁分泌功能抑制MG過度活化進(jìn)而減輕NPP的發(fā)展。但目前促炎因子預(yù)處理BMMSCs作用于NPP的研究較少。因此，研究預(yù)處理BMMSCs在NPP的發(fā)病過程中的作用具有重要意義。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)?/p>

3、的：
　　探討TNF-α預(yù)處理的BMMSCs對(duì)CCI大鼠鎮(zhèn)痛作用及可能機(jī)制
　　實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：
　　1、培養(yǎng)并鑒定BMMSCs。
　　2、體外情況下TNF-α預(yù)處理BMMSCs對(duì)其抑制MG活化作用的影響
　　3、鞘內(nèi)注射經(jīng)TNF-α預(yù)處理的BMMSCs對(duì)CCI大鼠MG活化及疼痛行為的影響
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、采用貼壁分離法從雄性SD大鼠（3-4周齡）的股骨中分離BMMSCs。光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、

4、流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　2、選擇雄性SD大鼠（6-8周齡）120只，參照Bennett法制備CCI模型，隨機(jī)分為3組(n=40);①CCI組（A組）：造模后第7天鞘內(nèi)注射不含BMMSCs的PBS20μl;②BMMSC移植組（B組）：造模后第七天鞘內(nèi)注射含BMMSCs（1×106/只）的PBS20μl;③TNF-α預(yù)處理BMMSCs組（C組）：造模后第七天鞘內(nèi)注射含TNF-α處理后的BMMSCs

5、（1×106/只）的PBS20μl。
　　3、觀察各組大鼠在手術(shù)前1天，術(shù)后第3、7、14、21、28天PWL、PWT。
　　4、分別于手術(shù)前一天，術(shù)后第3、7、14、21、28天采用頸椎脫臼法處死大鼠，分別取大鼠脊髓(SL)、腰段背根神經(jīng)節(jié)(DRG)。采用ELISA技術(shù)檢測SL、DRG內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-10炎性因子水平;分別于術(shù)后14天取SL、DRG，采用免疫熒光技術(shù)檢測SL、DRG小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD68

6、的表達(dá)水平。
　　5、為進(jìn)一步驗(yàn)證BMMSCs對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響，體外情況下采用LPS誘導(dǎo)MG活化，采用共培養(yǎng)的方法來檢測BMMSCs對(duì)LPS活化后的MG的作用。利用含1000ng/ml的TNF-α完全培養(yǎng)液對(duì)BMMSCs進(jìn)行預(yù)處理;利用LPS（10μg/ml）誘導(dǎo)大鼠MG活化。MG分離純化后，以1×105/孔種植于6孔板中，按以下分組將MG和BMMSCs進(jìn)行共培養(yǎng)24h。B組（單純BMMSCs組）、L+B組（LPS+BMMSCs

7、組）、T+B組（TNF-α預(yù)處理BMMSCs組）、L+T+B組（LPS+TNF-α預(yù)處理BMMSCs組）、M組（單純MG組）、L+M組（LPS+MG組）、B+L+M組(BMMSCs+LPS+MG組)、T+B+L+M組(TNF-α預(yù)處理BMMSCs+LPS+MG組)。
　　6、24h后，取培養(yǎng)液上清，采用ELISA技術(shù)檢測上清液中TNF-α、IL-6、IL-10等炎性因子表達(dá)含量，免疫熒光法檢測MG表面標(biāo)記物CD68抗體的表達(dá)水平。

8、
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、采用貼壁分離法培養(yǎng)的BMMSCs，隨著細(xì)胞不斷傳代純化，細(xì)胞形態(tài)呈長梭狀且呈旋渦狀排列，細(xì)胞表型鑒定結(jié)果如下：CD29表達(dá)率99.59％，CD90表達(dá)率83.95％，呈陽性;CD34表達(dá)率0.1％，CD45表達(dá)率7％，呈陰性。
　　2、與CCI組、單純BMMSC組相比，TNF-α預(yù)處理BMMSCs組術(shù)前1天、術(shù)后28天PWT和PWL差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);在術(shù)后第3天PWT和PWL逐

9、漸降低，術(shù)后第7天降至最低，之后緩慢升高，于術(shù)后28天恢復(fù)至基線水平，在此期間TNF-α預(yù)處理BMMSCs術(shù)后7、14、21天PWT、PWL值均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。肉眼可見TNF-α預(yù)處理BMMSCs組大鼠精神狀態(tài)好，術(shù)側(cè)傷口恢復(fù)較快;與CCI組和單純BMMSC組相比，差異顯著。
　　3、BMMSCs移植后進(jìn)行ELISA檢測發(fā)現(xiàn)：TNF-α預(yù)處理BMMSCs組腰段脊髓、腰段背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)TNF-α、IL-6等促炎

10、因子含量在術(shù)后第3、7天明顯升高，術(shù)后第14、21天促炎因子含量逐漸降低，術(shù)后28天促炎因子含量達(dá)到基線水平，與CCI組和單純BMMSC組相比，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。然而，TNF-α預(yù)處理BMMSCs組腰段脊髓、腰段背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)抑炎因子IL-10在術(shù)后第3、7表達(dá)呈低水平，在術(shù)后第14天逐漸上升，21天達(dá)到高峰，術(shù)后28天基本降至術(shù)前水平，與CCI組和單純BMMSC組相比，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)
　　

11、4、與CCI組和單純BMMSC組相比，SL、DRG中小膠質(zhì)細(xì)胞CD68表達(dá)水平明顯降低(p＜0.05)，而CD68在CCI組和單純BMMSC表達(dá)無明顯變化。
　　5、L+M組小膠質(zhì)細(xì)胞的CD68表達(dá)增高，分泌TNF-α、IL-6含量明顯增多;B+L+M組以及T+B+L+M組的小膠質(zhì)細(xì)胞CD68表達(dá)水平、TNF-α、IL-6分泌量低于L+M組，且B+L+M組與T+B+L+M組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：<