骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)TLR4-MyD88緩解脊髓損傷神經(jīng)病理性痛.pdf

1、背景與目的： 脊髓損傷（Spinal Cord Injury,SCI）是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，是目前公認(rèn)的疑難病之一，它具有致殘率高、醫(yī)療耗費(fèi)高等特點(diǎn)，既嚴(yán)重威脅了患者的健康，同時(shí)也極大影響了患者的生活質(zhì)量，給家庭以及社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。流行病學(xué)研究表明，中國(guó)每年大約有10萬(wàn)名患者。 SCI后常常伴隨著疼痛的發(fā)生，國(guó)際規(guī)定將SCI后疼痛分為感受性疼痛，神經(jīng)性疼痛以及其它疼痛，其中感受性疼痛發(fā)病率為50％，神

2、經(jīng)性疼痛發(fā)病率為59%。在所有的類型的疼痛中，神經(jīng)病理性痛（Neuropathic Pain, NP）最常見(jiàn)也最難治愈，藥物是脊髓損傷后神經(jīng)病理性痛（Neuropathic Pain After Spinal Crod Injury, SCI-NP）目前主要的治療方法，但是副作用大，大約只有1/3的患者能減輕50%的疼痛。近年來(lái)，以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）為代表的成體干細(xì)胞移植治療SCI

3、被給予了厚望，并在臨床得到了初步應(yīng)用，而MSCs對(duì)SCI-NP的影響研究甚少且存在爭(zhēng)議，因此研究MSCs移植對(duì)SCI-NP的影響以及如果去影響就顯得尤為必要。國(guó)內(nèi)外部分研究表明，SCI后移植MSCs可以緩解機(jī)械性痛和熱痛敏，阻止慢性痛的產(chǎn)生和發(fā)展。然而干細(xì)胞移植對(duì)緩解疼痛的效果也一直存在爭(zhēng)議。Hofstetter等將野生型的NSCs移植SCI-NP大鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)移植后大鼠運(yùn)動(dòng)功能提高的同時(shí)，其前肢出現(xiàn)痛覺(jué)超敏。因此深入探討MSCs移植對(duì)SC

4、I-NP的影響，以及其發(fā)揮作用的分子機(jī)制是本實(shí)驗(yàn)研究的主旨。 Toll樣受體4(Toll-like receptor4,TLR4)是一種模式識(shí)別受體目前已經(jīng)證明與免疫性或炎癥性疾病有著密切的關(guān)系,其激活后可通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)途徑生成并釋放大量的促炎因子。研究表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng),TLR4主要表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞，參與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，并在中樞免疫炎癥過(guò)程中起著重要的作用，Sorge RE等表明，TLR4與炎性痛以及NP密切相關(guān)。

5、MSCs被譽(yù)為對(duì)抗過(guò)度炎性反應(yīng)的“監(jiān)護(hù)人”，那么MSCs移植SCI-NP是否能夠通過(guò)降低TLR4的表達(dá)，從而減輕SCI后慢性炎癥和損傷所導(dǎo)致的痛覺(jué)過(guò)敏，目前仍未見(jiàn)報(bào)道，因此，本研究首先通過(guò)meta分析，評(píng)價(jià)MSCs移植對(duì)SCI-NP的影響，并在此基礎(chǔ)上，通過(guò)在損傷處原位移植MSCs，觀察移植前后SCI-NP模型大鼠組織學(xué)、行為學(xué)變化的規(guī)律，評(píng)估其移植緩解疼痛的效果，探討MSCs移植緩解SCI-NP大鼠疼痛的機(jī)制，為SCI-NP的MSCs

6、移植治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1.以"MSCs",＂Spinal cord injury＂和＂Neuropathic pain＂為關(guān)鍵詞，搜索文獻(xiàn)，通過(guò)meta分析對(duì)MSCs對(duì)SCI-NP的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)，分析課題的可行性； 2.設(shè)立100kdynes，150kdynes，180kdynes，200kdynes四組不同的打擊力度，于術(shù)前1d，術(shù)后7d、14d、21d和28d檢測(cè)大鼠機(jī)械痛閾的變化，同時(shí)在

7、術(shù)前1d，術(shù)后1d、3d、5d、7d、14d、21d和28d檢測(cè)大鼠BBB評(píng)分以及斜板實(shí)驗(yàn)的變化，確定最佳打擊力度； 3. 以最佳打擊力度建立SCI-NP模型，于術(shù)前1d，術(shù)后7d、14d、21d和28d檢測(cè)大鼠機(jī)械痛閾的變化，同時(shí)檢測(cè)術(shù)前1d，術(shù)后1d、3d、5d、7d、14d、21d和28d大鼠BBB評(píng)分和斜板實(shí)驗(yàn)的變化，免疫熒光（immunofluorescence, IF）和免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Westernblot, WB）

8、檢測(cè)SCI后膠質(zhì)細(xì)胞激活以及TLR4、MyD88、p-p38和p-NF-κB p65等相關(guān)分子表達(dá)的變化。ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-6和TNF-α表達(dá)的變化，HE染色和髓鞘染色檢測(cè)損傷處組織病理學(xué)改變； 4. 體外培養(yǎng)SD大鼠原代MSCs，并取P2代細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表面抗原CD34，CD45，CD44，CD90的表達(dá)，對(duì)原代培養(yǎng)的MSCs進(jìn)行鑒定；
　　5. 建立SCI-NP模型，并于術(shù)后7d，原位移植MSC

9、s，檢測(cè)移植前后大鼠機(jī)械痛閾及運(yùn)動(dòng)功能的變化，并通過(guò) IF 檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況，WB 檢測(cè) TLR4、MyD88、p-p38和p-NF-κB p65等分子表達(dá)的變化。ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-6和TNF-α表達(dá)的變化。 結(jié)果： 1. Meta分析的結(jié)果顯示，MSCs移植能夠緩解SCI后的機(jī)械痛敏，但是對(duì)熱痛敏無(wú)緩解作用， MSCs移植的最佳時(shí)間點(diǎn)為SCI后7d。 2. 打擊力度的摸索結(jié)果顯示，以100kdy

10、nes和150kdynes的打擊力度建模，均未能產(chǎn)生NP，而以180kdynes和200kdynes的打擊力度建模，均能夠產(chǎn)生NP，但200kdynes的打擊力度建模，機(jī)械痛閾下降的時(shí)間比180kdynes早，BBB評(píng)分以及斜板實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，兩種打擊力度建模，其運(yùn)動(dòng)功能并無(wú)明顯的差異，因此200kdynes為最佳打擊力度，并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的打擊力度。 3. 以200kdynes打擊力度建模后，大鼠雙后肢的機(jī)械痛閾在7d時(shí)即出現(xiàn)

11、明顯的下降，21d后逐漸穩(wěn)定，疼痛的持續(xù)時(shí)間超過(guò)28d。BBB評(píng)分結(jié)果顯示，SCI后1d大鼠BBB評(píng)分為下降為0，隨著損傷的進(jìn)程，運(yùn)動(dòng)功能逐漸恢復(fù)，BBB評(píng)分逐漸升高，于14d逐漸達(dá)到穩(wěn)定，但仍不能恢復(fù)到正常值。斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， SCI后，大鼠的支撐角度明顯下調(diào)，隨著損傷的進(jìn)程，逐漸恢復(fù)，但仍不能恢復(fù)到正常值。 4. SCI后24h，損傷處受壓變形，局部充血，伴隨著損傷進(jìn)程，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有脊髓空洞和脫髓鞘的發(fā)生。損傷

12、處星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活，且小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4，MyD88，p-p38，p-NF-κBp65表達(dá)上調(diào)；血清中IL-6和TNF-α的水平在24h即開(kāi)始上調(diào)，持續(xù)時(shí)間超過(guò)28d。 5. 體外原代培養(yǎng)MSCs，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，所培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)胞CD90，CD44表達(dá)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率分別為99.7%和86.5%；CD34，CD45表達(dá)為陰性，證明所培養(yǎng)細(xì)胞為MSCs。 6. 術(shù)后7d移植MSCs結(jié)果顯示，MSCs移植后，