miRNA在中國(guó)鱟胚胎發(fā)育中的表達(dá)分析.pdf

1、中國(guó)鱟是珍稀瀕危水生節(jié)肢動(dòng)物。中國(guó)鱟胚胎發(fā)育過程已經(jīng)清楚，但胚胎發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)理缺乏研究。本研究旨在挖掘中國(guó)鱟胚胎發(fā)育組織分化過程中重要的miRNA，揭示中國(guó)鱟胚胎發(fā)育調(diào)控的機(jī)理，為 miRNA代謝機(jī)制的深入研究提供基礎(chǔ)資料，同時(shí)為闡明中國(guó)鱟胚胎發(fā)育的滯育和解滯育的調(diào)控機(jī)理提供新的思路。
　　本研究以中國(guó)鱟為實(shí)驗(yàn)材料，模擬野外中國(guó)鱟繁殖的生態(tài)習(xí)性和環(huán)境條件，使親鱟在實(shí)驗(yàn)室條件下配對(duì)和產(chǎn)卵。取處于胚胎發(fā)育階段組織分化期的第一次胚內(nèi)

2、蛻皮期（Tt01）、第二次胚內(nèi)蛻皮期（Tt02）、第三次胚內(nèi)蛻皮期（WT03）和快速生長(zhǎng)期（第四次胚內(nèi)蛻皮期）（WT04）的胚胎，采用solexa技術(shù)進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序片段去除3’接頭序列、測(cè)序堿基長(zhǎng)度小于15 nt的序列和垃圾序列后，進(jìn)行Rfam數(shù)據(jù)庫和重復(fù)序列篩選。最后把所有的片段進(jìn)行注釋分類，找到4個(gè)階段中所有的miRNA，構(gòu)建4個(gè)階段的表達(dá)譜，進(jìn)行表達(dá)差異分析和保守性分析。對(duì)未知的 miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，包括二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，表

3、達(dá)差異分析和靶基因預(yù)測(cè)，然后進(jìn)行 GO功能注釋和 KEGG通路分析。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)對(duì)部分miRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以此驗(yàn)證solexa測(cè)序結(jié)果的可靠性。主要結(jié)果如下：
　　1.已知miRNA鑒定及差異表達(dá)分析
　　本研究共發(fā)現(xiàn)了9個(gè)已知miRNA，其中bmo-miR-10-5p_L+1、bmo-miR-10-3p_L-1R-1、lmi-miR-9a-5p_R-1和tca-miR-9a-5p_R+1表達(dá)豐度最高

4、，對(duì)其進(jìn)行差異表達(dá)分析后，發(fā)現(xiàn)其在4個(gè)階段的表達(dá)量有很大差異。其中miR-10家族與胚胎血管形成、組織生長(zhǎng)有關(guān)， miR-9a家族與胚胎組織分化有關(guān)。
　　2.未知miRNA的預(yù)測(cè)分析
　　本研究在4個(gè)胚胎發(fā)育分化階段共發(fā)掘出4835個(gè)新發(fā)現(xiàn)的miRNA。其中198個(gè)未知miRNA序列在節(jié)肢動(dòng)物門中存在保守性，但其前體序列在不同的物種中存在不同的序列堿基組成。在上述198個(gè)未知miRNA中挑選37個(gè)表達(dá)豐度高的miRNA構(gòu)建

5、表達(dá)譜并做進(jìn)一步分析。推測(cè)部分miRNA與中國(guó)鱟胚胎發(fā)育組織分化有關(guān)，分別是miR-375、miR-184、miR-7、let-7、miR-92a、miR-2a、miR-133、miR-34，其中miR-375與組織生長(zhǎng)有關(guān)，miR-184和miR-7與組織分化有關(guān)，let-7與胚胎后期發(fā)育成三葉蟲幼體有關(guān)，miR-92與血管生成有關(guān)，miR-2a與胚胎細(xì)胞凋亡有關(guān)，miR-133與胚胎中骨骼肌細(xì)胞分化有關(guān), miR-34與癌細(xì)胞生長(zhǎng)和

6、擴(kuò)散有關(guān)。
　　有89個(gè)新miRNA的成熟體序列無法比對(duì)到目前公布的節(jié)肢動(dòng)物門基因組上，本文暫未做研究；有4548個(gè)未知 miRNA的成熟體序列和前體序列均未被報(bào)道過，為全新未知miRNA。在上述4548個(gè)未知miRNA中挑選表達(dá)豐度高的15個(gè)miRNA構(gòu)建表達(dá)譜，并做進(jìn)一步分析。運(yùn)用RNAfold軟件預(yù)測(cè)miRNA前提二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)這15個(gè)miRNA都具有典型的二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。對(duì)這些miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，其中13個(gè)miRNA預(yù)