肺炎克雷伯菌CRP突變株的構(gòu)建及其生物膜表型分析.pdf

1、背景:肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP)是一種革蘭陰性桿菌。該菌在自然界分布廣泛，是一種重要的條件致病菌，常常引發(fā)社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院內(nèi)感染。近年來，在常見的革蘭陰性菌感染病例中，肺炎克雷伯菌已成為了僅次于大腸桿菌的重要條件致病菌，引起的感染類型主要包括敗血癥、泌尿系統(tǒng)感染和呼吸道感染。各種引起患者機(jī)體免疫力下降的因素都可以導(dǎo)致肺炎克雷伯菌感染，包括對(duì)激素藥物、免疫抑制劑和抗代謝藥物的使用，患者自身患有基礎(chǔ)

2、性疾病和采用侵入性的手術(shù)治療方式。并且，肺炎克雷伯菌可通過病人之間、病人與醫(yī)護(hù)人員和醫(yī)療用具的相互接觸而發(fā)生感染。為了更好的預(yù)防和治療由肺炎克雷伯菌引起的感染，有必要對(duì)它的致病機(jī)制進(jìn)行深入的研究。
　　生物膜的形成使得肺炎克雷伯菌能夠長(zhǎng)期地適應(yīng)并生存在宿主環(huán)境中，從而免于被血清因子殺滅和吞噬而傳播廣泛。cAMP受體蛋白(cyclic AMP receptor protein，CRP)可與cAMP相結(jié)合而影響著眾多毒力基因的表達(dá)，其

3、中包括參與肺炎克雷伯菌生物膜形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)過程。因此，推測(cè)肺炎克雷伯菌crp基因的缺失可能也會(huì)影響菌體的生物膜形成能力，繼而影響該菌的毒力及致病性。
　　目的:建立一種可行的肺炎克雷伯菌基因無痕敲除方法，為在分子水平上進(jìn)一步了解該菌毒力和致病性相關(guān)靶基因的調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。另外，驗(yàn)證突變株的表型與CRP基因缺失的對(duì)應(yīng)關(guān)系，分析回補(bǔ)株的表型能否回復(fù)到野生株的狀態(tài)。
　　方法:1.首先利用無痕敲除的方法構(gòu)建突變株。依據(jù)肺

4、炎克雷伯菌NTUH-K2044的基因組序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增crp基因兩側(cè)同源臂的引物，PCR擴(kuò)增得到兩側(cè)同源片段，用融合PCR的方法得到同源臂融合片段，酶切后克隆到自殺質(zhì)粒pKO3-km中，得到重組質(zhì)粒pKO3-km-△crp。利用同源重組的方法，得到crp基因缺失的突變株△crp。2.回補(bǔ)株的構(gòu)建。PCR擴(kuò)增得到crp基因片段，酶切處理后的crp片段克隆到載體pGEM-T-easy-km上，構(gòu)建得到回補(bǔ)質(zhì)粒pGEM-T-easy-km-

5、crp。將回補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入突變株△crp中，得到回補(bǔ)株C-△crp。3.生物膜表型的測(cè)定。用結(jié)晶紫染色法分別測(cè)定突變株，回補(bǔ)株和野生株的生物膜形成量，計(jì)算出它們各自的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
　　結(jié)果:建立了一種肺炎克雷伯菌無痕敲除的方法，并成功構(gòu)建了肺炎克雷伯菌突變株△crp，突變株基因組內(nèi)無任何抗性篩選標(biāo)記殘留。利用質(zhì)粒pGEM-T-easy-km構(gòu)建得到回補(bǔ)質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序正確后，轉(zhuǎn)入突變株中，獲得回補(bǔ)株C-△crp。對(duì)野生株、突變株和回補(bǔ)株

6、的生物膜形成能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明突變株的生物膜形成量少于回補(bǔ)株和野生株，且回補(bǔ)株能夠部分回復(fù)突變株的生物膜形成能力。
　　結(jié)論:crp基因缺失可以減弱肺炎克雷伯菌的生物膜形成能力，表明crp可能參與正向調(diào)控肺炎克雷伯菌生物膜形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而影響肺炎克雷伯菌生物膜形成?；匮a(bǔ)株C-△crp的生物膜表型可以部分回復(fù)到野生株的狀態(tài)，表明crp基因與肺炎克雷伯菌的生物膜形成具有一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，從而為進(jìn)一步研究crp基因影響肺炎