模擬微重力環(huán)境中肺炎克雷伯菌重要生理表型變化及其潛在機制研究.pdf

1、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）是一種廣泛存在于自然界及宿主體內(nèi)的革蘭陰性機會致病菌，在哺乳動物中該菌主要定植于宿主腸道、呼吸道及生殖泌尿道黏膜表面。當(dāng)前肺炎克雷伯氏菌主要引起住院患者的院內(nèi)感染，包括呼吸道、尿道、血液及傷口感染等。在亞洲部分地區(qū)，肺炎克雷伯氏菌是引發(fā)患者肝膿腫的主要病原體，并可繼發(fā)引起眼內(nèi)炎、腦膜炎等一系列嚴(yán)重并發(fā)癥。此外，肺炎克雷伯氏菌抗菌藥物耐藥性問題日趨嚴(yán)重，特別是伴隨 ESBLs及碳

2、青霉烯類耐藥菌株的出現(xiàn)及流行，臨床治療該菌相關(guān)感染的藥物選擇極為有限。
　　航天飛行中航天員免疫系統(tǒng)功能受抑，而在軌航天器內(nèi)部環(huán)境及航天員體內(nèi)也曾檢出肺炎克雷伯氏菌，對航天飛行中航天員的健康構(gòu)成潛在的威脅。微重力是太空環(huán)境的主要特點之一，但受限于實驗資源的稀缺性，真實微重力環(huán)境中進行細菌致病性及耐藥性研究機會極少。因此，基于地面模擬微重力技術(shù)的微生物研究必將為太空相關(guān)研究提供有益的補充和確證。借助于旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)（RCCS）及高

3、截面比培養(yǎng)皿（HARV）的廣泛應(yīng)用，本研究以肺炎克雷伯氏菌ATCC BAA-1705為實驗對象，在正常重力或模擬微重力環(huán)境中平行培養(yǎng)該菌，觀察其多種生理特性（生物被膜形成、毒力及抗菌藥物敏感性等）的改變，采用高通量的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）、定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)，探究相關(guān)表型變化可能的分子機制。
　　本研究將兩臺RCCS設(shè)置為模擬微重力（SMG）及正常重力（NG）兩種工作模式，每24 h分別在兩組中傳代培養(yǎng)

4、肺炎克雷伯氏菌，實驗周期為2周。培養(yǎng)過程中應(yīng)用光學(xué)或電子顯微鏡連續(xù)監(jiān)測兩組中細菌菌落和菌體形態(tài)的變化；培養(yǎng)結(jié)束后取出培養(yǎng)物觀察兩組中肺炎克雷伯氏菌生理特性的改變，如利用菌落形態(tài)及結(jié)晶紫實驗生物被膜形成情況，利用剛果紅和 Calcofluor染色、纖維素酶消化和酵母細胞凝集等實驗對肺炎克雷伯氏菌纖維素與 III型菌毛的合成情況進行定性及定量觀察。在此基礎(chǔ)上進行小鼠攻毒實驗，觀察兩組中肺炎克雷伯氏菌致病性差異。采用系列稀釋菌液涂布平板的方法

5、分離呈現(xiàn)表型異質(zhì)性生長的肺炎克雷伯氏菌亞群菌株，同樣分析了亞群菌株間生物被膜形成、纖維素與III型菌毛的合成、小鼠毒力及抗菌藥物敏感性等表型差異。通過高通量組學(xué)研究手段（如RNA-seq、定量蛋白質(zhì)組分析等）及qRT-PCR等實驗分析重要表型相關(guān)基因表達在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的差異。
　　經(jīng)過2周的連續(xù)傳代培養(yǎng)，本研究發(fā)現(xiàn)SMG組與NG組肺炎克雷伯氏菌均呈現(xiàn)出表型異質(zhì)性的生長特點，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為長鏈狀菌體的生成。與NG組比較，SMG組肺

6、炎克雷伯氏菌生物被膜形成能力增強，小鼠毒力增強（腹腔注射107 CFU細菌，14天觀察期內(nèi)SMG組小鼠死亡率為50％，而NG組無小鼠死亡），與生物被膜相關(guān)的纖維素及III型菌毛合成與表達也顯著升高。轉(zhuǎn)錄組測序顯示SMG組肺炎克雷伯氏菌覆蓋基因組不同位置的171個基因表達發(fā)生變化，89個基因表達上調(diào)，82個基因表達下調(diào)，經(jīng)KEGG分析88個差異表達基因可歸類為15個功能通路，主要涵蓋物質(zhì)代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。RNA-seq與qRT-PCR均

7、證實SMG組肺炎克雷伯氏菌III型菌毛編碼基因（mrkABCDF）及其正向調(diào)控子編碼基因（mrkH）表達水平均為NG組對應(yīng)基因的兩倍以上。
　　此外，本研究進一步分析了肺炎克雷伯氏菌生長過程中的表型異質(zhì)性。第2周培養(yǎng)結(jié)束時，SMG組或NG組培養(yǎng)物中均可分離得到4種肺炎克雷伯氏菌亞群菌株（命名為M1、M2、M3及M4），但兩組中亞群菌株構(gòu)成比例有不同之處。SMG組M1亞群占比最高（79.6%），其次為M3亞群（17.9%），M2占比

8、最低（2.5%）；NG組大多數(shù)亞群菌株為M3（69.6%），其次為M1（29.8%），M2占比同樣最低（0.6%）。M4菌株在兩組中極為罕見，占比忽略不計。
　　形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)M1亞群細胞周圍有莢膜，M2、M3及M4亞群細胞周圍均無莢膜存在，M2亞群細胞串聯(lián)排列形成鏈狀菌體結(jié)構(gòu)。表型實驗顯示M2亞群生物被膜形成能力相對最強，M4亞群次之，而M1及M3亞群幾無生物被膜形成能力。纖維素生成分析結(jié)果顯示與生物被膜形成密切相關(guān)的纖維素主要

9、由M2亞群合成及表達，其他亞群無纖維素生成或生成量極低；RNA-seq結(jié)果證實，相對于M1亞群纖維素合成基因的表達水平，SMG環(huán)境中M2亞群中纖維素合成核心酶編碼基因bcsA1及bcsA2表達顯著上調(diào)，其他纖維素合成相關(guān)基因中bcsC2與bcsD表達同樣顯著上調(diào)，而bcsZ2表達顯著下調(diào)。透射電鏡觀察顯示，SMG環(huán)境中肺炎克雷伯氏菌4種亞群均可形成III型菌毛；而甘露糖抵抗的酵母細胞凝集實驗顯示M1亞群III型菌毛形成最多，M2及M3亞

10、群次之，M4亞群最少，與RNA-seq結(jié)果一致。
　　小鼠毒力實驗中（腹腔注射107 CFU細菌），SMG環(huán)境中培養(yǎng)的M1亞群毒力相對最強（14天觀察期內(nèi)小鼠死亡率為75%），其他亞群同等菌量攻毒后觀察期內(nèi)均未引起小鼠死亡?？咕幬锩舾行詫嶒灲Y(jié)果顯示M2亞群對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物敏感性增強，其他亞群菌株對該類抗菌藥物敏感性無明顯變化；qRT-PCR證實與M1亞群對應(yīng)基因相比，M2亞群中KPC-2型碳青霉烯酶編碼基因blaKPC-2

11、表達顯著降低，而其耐藥相關(guān)的外膜孔蛋白編碼基因（ompK36）及外排泵編碼基因（acrAB）表達無明顯變化。
　　此外，定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示，相對于M1亞群，M2亞群157個蛋白表達發(fā)生顯著變化，其中36個蛋白表達顯著增多，121個蛋白表達顯著減少。其中M2亞群KPC-2型碳青霉烯酶表達顯著降低（為M1亞群0.21倍），而外膜孔蛋白及外排泵相關(guān)蛋白表達無明顯變化，與 qRT-PCR一致。上述結(jié)果證實碳青霉烯酶表達下降是M2亞群對

12、β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物敏感性增強的主要原因。
　　SMG環(huán)境中肺炎克雷伯氏菌生物被膜形成能力增強與其纖維素及III型菌毛合成及表達增多密切相關(guān)，小鼠毒力增強與該環(huán)境中毒力較強的M1亞群比例更高相關(guān)。為適應(yīng)SMG環(huán)境，肺炎克雷伯氏菌呈現(xiàn)表型異質(zhì)性的生長特點，及最初菌株可分化產(chǎn)生生理特點差異較大的亞群菌株。M2亞群串聯(lián)排列的鏈狀菌體顯示出細菌間相互黏附的多細胞行為；纖維素對維持M2亞群菌體間相互黏附及生物被膜形成有重要作用；本研究中KP