姜黃素減緩模擬微重力誘導的骨質丟失機制的實驗研究.pdf

1、目的：
　　微重力條件下，人體受力學環(huán)境的改變會引起人體多個系統(tǒng)、器官和組織發(fā)生顯著而持續(xù)的生理病理變化，而微重力誘發(fā)的骨質丟失是其中非常突出的問題之一。微重力引發(fā)的骨質疏松增加了骨折的風險，限制了人類對太空的探索;而且微重力與長期臥床制動誘發(fā)的骨質疏松，同屬廢用性骨質疏松，病理機制非常相似。因此，研究微重力環(huán)境下誘發(fā)骨質丟失的機制并找到相應的對抗策略，對于宇航人員和長期臥床的人群都具有非常重要的意義。
　　目前，微重力誘發(fā)

2、骨質丟失的確切機制尚不清楚，現(xiàn)有的對抗方案也不理想。近些年，氧化應激(Oxidative stress)在骨質疏松病理機制中的作用引起廣泛關注。在雌激素水平下降和年齡增長引發(fā)的骨質疏松中，都發(fā)現(xiàn)活性氧自由基(ROS，Reactive oxygen species)在體內大量蓄積，而且應用抗氧化應激藥物在防治上述兩種骨質疏松方面也取得了不錯的效果。近來，學者們發(fā)現(xiàn)氧化應激可能在微重力誘發(fā)的骨質丟失方面也起到了非常重要的作用，并且通過體外實

3、驗也取得了積極效果。因此，有必要尋找或開發(fā)具備抗氧化應激的理想藥物，來防治微重力誘發(fā)的骨質丟失。
　　姜黃素(C21H20O6)是從姜黃的根莖中提取的一種天然酚醛樹脂，是一種天然抗氧化劑以及自由基清除劑。作為烹飪調味品，它已經被東方民族廣泛應用，還用于治療疾病，包括糖尿病、肝膽病變、類風濕關節(jié)炎和胃腸病變等。近來，姜黃素作為潛在的治療絕經后骨質疏松藥物引起了科學家的關注。它可以改善絕經后引起的骨質疏松，以及牙周炎引起的骨質丟失。另

4、外，姜黃素可改善APP/PS1轉基因小鼠的骨纖維結構和提高骨礦質密度。有的報道認為姜黃素是雙向抗氧化劑，它能夠直接與活性氧反應，誘導具有細胞保護作用和抗氧化作用的蛋白質表達上調。另外，姜黃素也能夠與維生素D受體結合(VDR)，激活維生素D受體目標基因的轉錄。而姜黃素能否緩解微重力條件下引發(fā)的骨質丟失，還有待探討。
　　目的：
　　1.研究姜黃素對于模擬微重條力件下成骨細胞代謝和分化等功能的影響，并探討其作用機制。
　　

5、2.研究姜黃素對于模擬微重條力件下破骨細胞生成和代謝的影響，并探討其作用機制。
　　3.研究模擬微重力條件對于SD大鼠骨代謝的影響，探討姜黃素對于模擬微重力條件下SD大鼠骨質丟失的影響及其作用機制。
　　方法：
　　1.旋轉式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS，Rotary cell culture system)模擬體外微重力條件，體外培養(yǎng)MC3T3-E1細胞。根據(jù)不同處理方法將實驗細胞分為四組:(1)1G重力對照組(Con);

6、(2)1G重力+姜黃素對照組(Con+CUR，4μM);(3)模擬失重組(MG);(4)模擬失重+姜黃素組(MG+CUR，4μM)。實驗組加入姜黃素（4μM）共同模擬微重力條件下培養(yǎng)96h后，檢測細胞中ROS產量及培養(yǎng)液中OPG和RANKL含量;用pRT-PCR(Quantitative real-time PCR analysis)法結合WesternBlot法檢測VDR的表達水平。實驗組加入姜黃素（4μM）共同培養(yǎng)7天后，檢測ALP

7、活力水平。然后綜合評估微重力條件對MC3T3-E1細胞增殖及分化功能的影響，并探討姜黃素在其中發(fā)揮的作用及其機制。
　　2.旋轉式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)（RCCS，Rotary cell culture system）模擬體外微重力條件，體外培養(yǎng)MC3T3-E1細胞。根據(jù)不同處理方法將實驗細胞分為五組(1)1g重力組(Con)(2)模擬失重組(MG);(3)模擬失重+1,25-二羥維生素D組(MG+1,25D,10 nM);(4)模擬失重+

8、姜黃素組(MG+curcumin，4μM)(5)模擬失重+1,25-二羥維生素D+姜黃素組(MG+1,25D+ curcumin，4μM和10 nM)。同方法1,檢測ROS、 ALP和RANKL/OPG，對比分析姜黃素與1,25D對MC3T3-E1細胞代謝和分化的影響.
　　結果：
　　1.MC3T3-E1在RWVB中孵育96 hours后，檢測發(fā)現(xiàn)相比于正常重力組(Con)，模擬微重力組(MG) MC3T3-E1細胞培養(yǎng)液

9、中ROS含量升高了48.2％(p=0.002)，而模擬微重力+姜黃素組(MG+CUR)與單純模擬微重力組(MG)組相比ROS水平下降了26.6％(p=0.014)。
　　2.MC3T3-E1在RWVB中孵育96 hours后，檢測發(fā)現(xiàn)相比于相比于正常重力組(Con)，模擬微重力組(MG) MC3T3-E1細胞培養(yǎng)液中OPG產量下降了17.5％(p＜0.001)，而MG+CUR組與MG組相比OPG產量升高了19.9％(p＜0.001

10、);相比于正常重力組(Con)，模擬微重力組(MG)組RANKL產量明顯增加(p＜0.001)，RANKL/OPG比值顯著升高(p＜0.001);而MG+CUR組與單純模擬微重力組(MG)組相比RANKL產量明顯下降(P＜0.05)，相比于單純模擬微重力組(MG）組，MG+CUR組RANKL/OPG比值明顯下降(p＜0.001)。
　　3.MC3T3-E1在RWVB中孵育96 hours后，檢測發(fā)現(xiàn)相比于正常重力組(Con)，模擬

11、微重力組(MG) MC3T3-E1細胞的VDR mRNA表達水平下降了68％(p＜0.001)和蛋白表達水平下降了72％(p＜0.001);而MG+CUR組與單純模擬微重力組(MG)組相比，VDR mRNA(p＜0.001)表達水平升高了194％而蛋白質表達水平升高了168％(p＜0.001)。
　　4.MC3T3-E1細胞在RWVB中孵育養(yǎng)7天后，ALP檢測發(fā)現(xiàn)相比于正常重力組(Con)，模擬微重力組(MG) MC3T3-E1細

12、胞的ALP活性明顯降低(p=0.005)，而模擬微重力+姜黃素組(MG+CUR)組與單純模擬微重力組(MG)組相比ALP活性明顯升高(p=0.020)。
　　5.同方法1處理MC3T3-E1細胞后，檢測發(fā)現(xiàn)相比于Con組，MG組MC3T3-E1細胞ROS水平顯著升高(p=0.001)，MG組與MG+1,25D組相比無明顯差異(p=0.54);而MG+CUR組和MG+1,25D+CUR組與MG組相比ROS水平顯著下降(p=0.006

13、;p=0.001)。而MG+CUR組與MG+1,25D+CUR組相比無明顯差異(p=0.74)。
　　結論：
　　1.模擬微重力使MC3T3-E1細胞ROS水平升高，抑制細胞的增殖分化能力;而姜黃素能夠明顯減弱模擬微重力對MC3T3-E1的抑制作用，降低ROS水平，上調MC3T3-E1細胞VDR表達水平。
　　2.模擬微重力條件使RAW254.7細胞ROS水平升高，有利于破骨細胞生成，并使破骨細胞活力增強，而姜黃素能夠