力學載荷與CKIP-1基因缺失對抗微重力下骨質疏松的實驗研究.pdf

1、背景：骨質疏松癥（OP，osteoporosis）主要是因為骨重塑過程平衡被打破，骨形成與骨吸收過程中后者占主導地位，導致骨量減少、骨微結構破壞、骨折概率增大的一種嚴重危害患者生命健康的骨代謝疾病。大量研究表明，酪蛋白激酶2相互作用蛋白1（casein kinase2-interacting protein-1，CKIP-1）在骨組織增殖、分化過程中起重要作用，其主要與泛素連接酶Smurf1相互作用進而影響骨生長的過程；近年來，大量研究

2、證明力學環(huán)境與骨組織生長狀況關系十分密切，力學載荷越來越受到大家的關注，尤其是在成骨效應方面。
　　目的：通過尾吊飼養(yǎng)方法模擬失重環(huán)境，進而建立失重性骨質疏松的小鼠模型，研究小鼠脛骨軸向生理性載荷（2500με）與過載（5000με）以及CKIP-1基因敲除對骨質疏松的對抗與治療作用；希望為臨床治療骨科相關疾病，尤其是太空環(huán)境下微重力導致的失重性骨疏松提供一種新的預防或治療方法，為長期在太空飛行的航天員預防保健提供專業(yè)的參考意見和

3、理論基礎。
　　方法：
　　1.骨質疏松模型的建立：將2-3月齡C57BL/6J小鼠隨機分為2組，對照組（Normal）、尾吊組（TS），適應性飼養(yǎng)1W后，對照組常規(guī)飼養(yǎng)，尾吊組進行鼠尾懸吊飼養(yǎng)，實驗周期為4W，試驗結束后分別檢測兩組小鼠脛骨微觀參數(shù)、力學性能、血生化指標等，觀察建模結果。
　　2.不同強度周期性動態(tài)力學載荷對微重力下骨質疏松的作用：將2-3月齡C57BL/6J小鼠隨機分為4組，對照組（Normal）、

4、尾吊組（TS）、尾吊+生理性載荷組（Loading）、尾吊+過載組（Overloading），適應性飼養(yǎng)1W后，對照組正常飼養(yǎng)，其他各組尾吊飼養(yǎng)4周。尾吊期間，尾掉組小鼠不作其他處理，生理性載荷組小鼠后肢左側脛骨施加周期性動態(tài)力學載荷（使其脛骨中段受到的峰值應變約為2500με），過載組小鼠后肢左側脛骨施加力學載荷產(chǎn)生的微應變約為5000με。加載時間為20min，加載頻率為15Hz，1次/3d。試驗周期結束后，處死小鼠，斷頭取血，靜止

5、10min后，3000r/min離心30min，取上層血清﹣80℃保存，以備后用。同時，剝離出小鼠后肢離體脛骨，液氮中保存。
　　采用小動物活體計算機斷層掃描系統(tǒng)SkyScan1076進行Micro CT掃描實驗進行骨小梁微觀結構檢測；干骺端三點彎曲力學實驗檢測小鼠脛骨骨組織宏觀力學性能；血清AKP與BGP含量檢測成骨活性；實時熒光定量PCR技術檢測相關成骨基因表達情況。
　　3.生理性載荷與CKIP-1基因敲除對抗微重力下

6、骨質疏松的作用：將2-3月齡C57BL/6J小鼠隨機分為2組，尾吊組（TS）、尾吊+生理性載荷組（Loading）；同時將CKIP-1基因敲除小鼠隨機分為2組，尾吊組（記為KO）、尾吊+生理性載荷組（記為KO+Loading），這樣得到共4組小鼠。適應性飼養(yǎng)1W后，對照組正常飼養(yǎng)，其他各組尾吊飼養(yǎng)4周。尾吊期間，尾掉組小鼠不作其他處理，生理性載荷組小鼠后肢左側脛骨施加周期性動態(tài)力學載荷（使其脛骨中段受到的峰值應變約為2500με）。加載

7、時間為20min，加載頻率為15Hz，1次/3d。試驗周期結束后，處死小鼠，斷頭取血，靜止10min后，3000r/min離心30min，取上層血清﹣80℃保存，以備后用。同時，剝離出小鼠后肢離體脛骨，液氮中保存。
　　采用小動物活體計算機斷層掃描系統(tǒng)SkyScan1076進行Micro CT掃描實驗進行骨小梁微觀結構檢測；干骺端三點彎曲力學實驗檢測小鼠脛骨骨組織宏觀力學性能；血清AKP與BGP含量檢測成骨活性；實時熒光定量PCR

8、技術檢測相關成骨基因表達情況。
　　結果：
　　1.骨質疏松模型評價：小鼠尾吊4周后，與正常飼養(yǎng)小鼠相比，尾吊組小鼠骨組織大量流失，骨生物力學性能明顯降低，骨微觀結構發(fā)生破壞、成骨活性顯著減弱，說明成功復制了骨質疏松模型。
　　2.不同強度周期性力學載荷對微重力下骨質疏松的影響：相比尾吊組，生理性載荷組改善了小鼠脛骨的宏觀力學性能（P＜0.05）；過載組也可稍改善尾吊導致的力學性能下降，但作用不明顯（P＞0.05）。對

9、小鼠后肢脛骨施加2500微應變后，與尾吊組相比，生理性載荷組小鼠脛骨微觀結構得到了顯著改善（P＜0.05），但與對照組相比統(tǒng)計學檢驗有顯著性差異（P＜0.05）；當脛骨承受5000微應變時，該組骨小梁微觀結構與尾掉組相比有改善的趨勢，但改變程度沒有顯著性差異（P＞0.05）。施加周期性動態(tài)力學載荷可增強成骨活性，并抑制微重力致骨質疏松的發(fā)生與發(fā)展。其中，生理性載荷作用顯著（P＜0.05），過載則作用不明顯（P＞0.05）。生理性載荷可以

10、有效上調BMP-1、Col-I、AKP的表達，增強成骨作用（P＜0.05）；過載亦有上述作用，但結果沒有顯著性差異（P＞0.05）。
　　3.生理性載荷與CKIP-1基因對微重力下骨質疏松的對抗與治療作用：干骺端三點彎曲實驗顯示，與尾吊組相比，生理性載荷和CKIP-1基因的缺失均能顯著改善由尾吊所致小鼠脛骨組織的力學性能降低的情況，主要表現(xiàn)在其斷裂應變、斷裂能量的提高（P＜0.05），且二者聯(lián)合作用，改善效應增強。小鼠脛骨微觀參數(shù)

11、分析發(fā)現(xiàn)生理性載荷與CKIP-1基因敲除可以有效抑制尾吊所致骨密度降低、骨組織大量流失等情況（P＜0.05）。血清AKP與BGP含量測定結果顯示，生理性載荷與CKIP-1基因敲除可以提高與成骨活性相關的AKP與BGP含量，證明上述因素可以提高成骨活性（P＜0.05），促進成骨。實時熒光定量PCR結果顯示，生理性載荷與CKIP-1基因敲除可以上調成骨相關基因的表達（P＜0.05），抑制骨質疏松的發(fā)生與發(fā)展。
　　結論：研究通過尾吊飼

12、養(yǎng)小鼠模擬微重力環(huán)境導致骨質疏松，盡管與真正意義上的太空微重力環(huán)境有一定的差距，并不能完全展示出微重力環(huán)境下骨質疏松發(fā)生的過程，但是該模型作為一種較為成熟的模擬太空微重力環(huán)境的方法，其結果可以為太空長期作業(yè)人員提供一種可能的預防或治療骨質疏松的方法。
　　主要結論如下：
　　1.小鼠尾吊4周后，可成功復制失重性骨質疏松模型；
　　2.生理性載荷與CKIP-1基因敲除均可有效抑制骨質疏松的發(fā)生與發(fā)展，基因的調控效應大于力