糖尿病小鼠調(diào)節(jié)肺炎克雷伯菌肝膿腫發(fā)病機制的分子機制.pdf

1、研究目的：
　　1.分析肝膿腫患者的臨床特點，觀察經(jīng)皮穿刺引流術(shù)對肝膿腫的治療效果，分析影響療效的因素。
　　2.肺炎克雷伯菌感染后，比較糖尿病小鼠和正常小鼠肝臟炎癥反應(yīng)病理學(xué)、細(xì)胞因子及炎癥信號通路蛋白表達量差異，探討糖尿病小鼠肺炎克雷伯菌肝膿腫發(fā)病率高的分子機制。
　　研究方法：
　　1.收集上海某三甲醫(yī)院介入血管外科從2011年1月至2016年1月收治的121例肝膿腫患者臨床資料。對確診肝膿腫患者，充分抗感

2、染的同時，CT評估病灶液化情況，在CT引導(dǎo)下行經(jīng)皮肝穿刺引流術(shù)，分析患者的一般資料、實驗室檢查、膿腫大小及位置、合并癥、致病菌、治療后的病死率、并發(fā)癥率、住院時間及其影響因素。
　　2.①DM模型構(gòu)建：有48只健康雄性的ICR小鼠，8周齡。從中隨機選取24只小鼠，用STZ腹腔注射，以120mg/kg的劑量，構(gòu)建糖尿病模型，作為糖尿病組，另外24只小鼠腹腔注射等量檸檬酸鹽緩沖液，作為正常組。1周后，用血糖儀監(jiān)測血糖，如果小鼠血糖值>

3、20mmol/L，視為糖尿病模型小鼠。②肝膿腫模型構(gòu)建：DM模型構(gòu)建成功后1個月，制備3×10*7CFU/50ul肺炎克雷伯菌細(xì)菌混懸液,隨機選取糖尿病組和正常組小鼠各12只，按每只小鼠口腔灌胃3×10*8 CFU肺炎克雷伯菌的劑量感染小鼠。2組各另外8只小鼠口腔灌胃等劑量的PBS溶液。③實驗分組：肺炎克雷伯菌-糖尿病組、肺炎克雷伯菌-正常組、PBS-糖尿病組、PBS-正常組。④肝組織病理學(xué)檢查：在灌胃72h以后，在無菌條件下取出小鼠肝

4、臟。病理學(xué)觀察比較PBS-糖尿病組、PBS-正常組、肺炎克雷伯菌-糖尿病組、肺炎克雷伯菌-正常組肝細(xì)胞水腫程度、炎癥細(xì)胞聚集情況、形成膿腫情況。⑤ELISA法比較4組小鼠肝臟炎癥細(xì)胞因子 IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、MIP-1α、TNFα的表達量,Western blot觀察4組小鼠肝臟IκΚα和Iκκβ、Iκ Bα、NF-ΚB及磷酸化值的表達量。
　　研究結(jié)果：
　　1.共有121例肝膿腫患者納入研究，均做

5、了膿液細(xì)菌培養(yǎng)或血培養(yǎng)。其中檢出肺炎克雷伯菌60例（49.59%），大腸桿菌3例（2.5%）。肝膿腫合并糖尿病60例（50.42%）。2例患者穿刺引流后死亡，病死率為1.65%，影響患者死亡率的因素為高齡、基礎(chǔ)疾病，膿腫直徑及實性成分；2例患者穿刺引流后出現(xiàn)肝周膿腫、腹壁膿腫，并發(fā)癥率為1.65%，對并發(fā)癥積極處理后達到臨床治愈，影響并發(fā)癥率的因素主要為手術(shù)操作欠妥；119例患者均達到臨床治愈，治愈率為98.34%，平均住院時間為（15

6、.13±6.07）天。影響住院時間的危險因素為：膿腫個數(shù)X6（r=0.232,P=0.021），膿腫大小X7（r=0.26,P=0.005）,白細(xì)胞計數(shù)X8（r=0.238,P=0.009）。進一步分析顯示影響因素與住院時間相關(guān)性的多元線性回歸方程有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），多元回歸方程為： Y=-3.438+3.055X6+0.527X7+0.297X8，F(xiàn)=5.819，R2=0.416。性別、年齡、糖尿病、致病菌、膿腫位置對住院時

7、間的影響無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。
　　2.STZ注射一周后，用血糖儀檢測糖尿病組24只小鼠血糖值，均>20mmol/L。觀察糖尿病組小鼠，毛黃、稀疏，多飲、多食、多尿，消瘦，呈現(xiàn)明顯的“三多一少”癥狀。糖尿病組小鼠血糖較正常組明顯升高（P<0.05），糖尿病組與正常組小鼠體重?zé)o明顯差異（P>0.05）。肺炎克雷伯菌灌胃感染小鼠后，無菌條件下取小鼠肝臟，HE染色實驗結(jié)果表明：肺炎克雷伯菌-糖尿病組膿腫形成個數(shù)較肺炎克雷伯菌-正

8、常組增多(P<0.05)。ELISA實驗結(jié)果表明：肺炎克雷伯菌-糖尿病組肝臟IL-1β、IL-2、IL-6、MIP-1α、TNF-α的表達量明顯高于肺炎克雷伯菌-正常組（P<0.05）,肺炎克雷伯菌-糖尿病組肝臟IL-1β、IL-2、IL-6、MIP-1α、TNF-α表達量高于PBS-糖尿病組(P<0.05)，肺炎克雷伯菌-正常組肝臟IL-1β、IL-2、IL-6、MIP-1α、TNF-α表達量高于PBS-正常組(P<0.05)。Wes

9、tern blot實驗結(jié)果表明：肺炎克雷伯菌-糖尿病組P-IΚΚβ、P-IΚΒα、P-NFΚΒ表達量明顯高于肺炎克雷伯菌-正常組（P<0.05）,肺炎克雷伯菌-糖尿病組P-IΚΚα、P-IΚΚβ、P-IΚΒα、P-NFΚΒ表達量高于PBS-糖尿病組（P<0.05）,肺炎克雷伯菌-正常組P-IΚΚα、P-IΚΚβ、P-IΚΒα、P-NFΚΒ表達量高于PBS-正常組（P<0.05）。
　　研究結(jié)論：
　　1. CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肝穿

10、刺引流聯(lián)合抗生素能有效治療肝膿腫，具有病死率低，治愈率高，并發(fā)癥率低、住院時間短等優(yōu)點，值得臨床推廣應(yīng)用。糖尿病確實是誘發(fā)肝膿腫的高危因素，但當(dāng)血糖水平控制在正常范圍內(nèi)時，糖尿病可以不影響住院時間。
　　2.本實驗成功構(gòu)建了ICR小鼠1型糖尿病模型及小鼠的肺炎克雷伯菌肝膿腫模型，并且證實了糖尿病小鼠肺炎克雷伯菌肝膿腫發(fā)病率增高，探索了其分子機制是細(xì)胞NF-ΚΒ信號通路的過度激活擴大了炎癥反應(yīng)進程，加重了肝細(xì)胞壞死程度，導(dǎo)致膿腫發(fā)病