小鼠造模過程中組蛋白表觀修飾變化與糖尿病發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是以持續(xù)性高血糖為主要特征的一種慢性全身性代謝紊亂疾病，其主要是由于體內(nèi)胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足，或由于組織對(duì)胰島素敏感性降低（胰島素抵抗）所導(dǎo)致。目前，全球糖尿病患者有近3億，僅中國(guó)就超過1個(gè)億的患者，已成為世界糖尿病第一大國(guó)。近年來，隨著全球老齡化、城市化進(jìn)程的加快以及人們生活方式的變化，糖尿病發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)且發(fā)病人群向年輕化發(fā)展。糖尿病已成為嚴(yán)重威脅人類健康的慢性流行疾病，

2、嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及壽命，但糖尿病的發(fā)病原因至今仍未被完全闡明。因此，盡快揭示2型糖尿病的發(fā)病機(jī)理，發(fā)現(xiàn)治療糖尿病的有效靶點(diǎn)，研發(fā)標(biāo)本兼治的糖尿病治療藥物，是學(xué)術(shù)界亟待解決的重要課題。
　　表觀遺傳對(duì)生物體各類細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化至關(guān)重要，并隨著年齡的增長(zhǎng)發(fā)生規(guī)律性變化。如果環(huán)境因素的影響使這種正常的變化規(guī)律被打破或異常改變，就可能引發(fā)各種復(fù)雜疾病。許多研究表明，表觀遺傳修飾可能是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中連接環(huán)境和基因相互作用的橋梁

3、，或是揭示2型糖尿病發(fā)生機(jī)制的關(guān)鍵所在。組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)的一個(gè)重要內(nèi)容，組蛋白密碼被一系列蛋白復(fù)合物識(shí)別并翻譯成特定的染色質(zhì)狀態(tài)，具有十分重要的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。然而組蛋白修飾在2型糖尿病發(fā)生過程中是否起到了關(guān)鍵性作用，如何影響糖尿病相關(guān)基因的表達(dá)，以及它們之間是否存在內(nèi)在聯(lián)系等問題目前尚不十分清楚。
　　本研究通過采用高脂高糖飼料飲食輔助腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ）對(duì)C57BL/6J小鼠進(jìn)行造模，成功誘發(fā)了2型糖尿病

4、小鼠模型，模擬人類2型糖尿病發(fā)病過程，成模后的小鼠再經(jīng)艾塞那肽（Exentide-4）治療，小鼠的各種生理指標(biāo)都得到了改善。至此，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常組（Con組），糖尿病組（T2D組）以及治療組（Ex-4組）進(jìn)行后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)。
　　肝臟和胰腺是糖代謝的重要器官，本研究通過Western Blot檢測(cè)了組織總組蛋白H3的表觀修飾情況，結(jié)果表明與正常組相比，糖尿病組小鼠肝臟中組蛋白H3的H3K23Ac和H3K9Ac水平均明顯下降（P<

5、0.01），治療組H3K9Ac的水平顯著升高（P<0.01），而H3K23Ac的水平持續(xù)下調(diào)，且差異顯著（P<0.01）；與之相反，與正常組相比，H3K4Me和H3K9Me2水平在糖尿病小鼠中均顯著上調(diào)（P<0.01），經(jīng)治療后H3K4Me和H3K9Me2水平明顯下調(diào)（P<0.01），已接近正常組的水平。胰腺組蛋白修飾情況與肝臟不同，與正常組相比，糖尿病組小鼠的H3K23Ac和H3K9Ac水平均明顯上升（P<0.01），治療組H3K23

6、Ac、H3K9Ac的水平顯著下調(diào)（P<0.01、P<0.05），且差異顯著；與之相反，與正常組相比，H3K4Me水平在糖尿病小鼠中顯著下調(diào)（P<0.05），治療組小鼠組蛋白H3K4Me水平有所上升，但差異不顯著；相反，糖尿病小鼠的H3K9Me2水平比正常組明顯上升（P<0.05），治療后又顯著下降（P<0.05）。表明糖尿病小鼠的確出現(xiàn)了肝臟、胰腺組蛋白乙?；凹谆揎棶惓?，而經(jīng)過治療后，這種異常修飾能夠得到不同程度的矯正或恢復(fù)，推測(cè)

7、肝臟、胰腺的表觀遺傳修飾水平變化可能與2型糖尿病的發(fā)病有關(guān)。
　　應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了肝臟、胰腺中與糖尿病相關(guān)的基因表達(dá)量，結(jié)果表明，與正常組相比，肝臟Glut-2，Gck，Pklr在糖尿病組鼠中的表達(dá)量均顯著下調(diào)（P<0.01），經(jīng)艾塞那肽治療后Glut-2和Pklr的表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.01），Gck也有所上調(diào)（P<0.05）。Ppargc1a的表達(dá)量在糖尿病組中下調(diào)，經(jīng)治療后有所上升。與正常組相比，Insr在糖尿病組

8、中的表達(dá)量下調(diào)（P<0.05），治療后有所上調(diào)。與正常組相比，糖尿病組小鼠胰腺Pdx1表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.01），治療后得到顯著上調(diào)（P<0.01）；糖尿病小鼠Ins1基因的表達(dá)量也明顯下調(diào)（P<0.05），治療后又出現(xiàn)明顯的上升（P<0.05）。同時(shí)Pax4基因在各組中的表達(dá)量與Pdx1及Ins1一致，但差異均未達(dá)到顯著水平。Bcl2和Caspase3在各組的表達(dá)量恰好相反，與正常組相比，糖尿病小鼠Bcl2表達(dá)量明顯降低（P<0.

9、05），治療后顯著上調(diào)（P<0.01）；而Caspase3在糖尿病組中的表達(dá)量是顯著上調(diào)的（P<0.01），治療組中該基因的表達(dá)水平有所下降。這些結(jié)果表明，高脂高糖飲食結(jié)合注射STZ誘發(fā)2型糖尿病的小鼠肝臟、胰腺中出現(xiàn)了相關(guān)基因的表達(dá)異常，治療后病情緩解的情況下這些異常又表現(xiàn)出不同程度的恢復(fù)。此外，本研究選擇了胰腺組織檢測(cè)組蛋白表觀修飾酶基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，小鼠胰腺組蛋白乙?；窹300，去乙?；窼irt1、HDAC2，組蛋白甲

10、基轉(zhuǎn)移酶SUV39h2以及去甲基化酶Kdm3a基因在各組中的表達(dá)量與胰腺整體組蛋白在各組中的修飾水平相吻合。
　　最后選取小鼠肝臟和胰腺中表達(dá)量變化較大的基因Glut2和Pdx1，利用ChIP技術(shù)檢測(cè)了其啟動(dòng)子區(qū)組蛋白的修飾水平。結(jié)果顯示糖尿病組小鼠肝臟Glut2基因啟動(dòng)子區(qū)H3K9Me2和H3K4Me的富集均比正常組上升（P<0.01），經(jīng)過艾塞那肽治療后，富集程度均下降（P<0.01）；組蛋白H3Ac水平在糖尿病組中顯著低于正

11、常組（P<0.01），治療后H3Ac的富集程度明顯上升（P<0.05）；相反，組蛋白H3K9 Ac的富集在糖尿病組中有所升高（P<0.05），治療后H3K9Ac的富集程度在持續(xù)上升（P<0.01）。同時(shí)，2型糖尿病小鼠胰腺中Pdx1基因啟動(dòng)子區(qū)H3K9Me2的富集與正常組相比顯著上升（P<0.01），經(jīng)治療又明顯下降（P<0.01），相反，H3K4Me的富集在糖尿病組中顯著下降（P<0.01），而治療組H3K4Me的水平又明顯上升（P<

12、0.01）；Pdx1啟動(dòng)子區(qū)H3Ac和H3KAc水平在糖尿病組中均顯著低于正常組（P<0.01），治療后二者的富集程度均明顯上升（P<0.05）。H3K9Me2修飾抑制相關(guān)基因表達(dá)，而H3K4Me以及組蛋白的各種乙?；揎梽t促使相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，這與Glut2、Pdx1基因在各組表達(dá)水平變化趨勢(shì)基本吻合。
　　本研究通過研究小鼠誘發(fā)糖尿病過程中組蛋白表觀修飾模式變化，闡明組蛋白表觀修飾與糖尿病發(fā)病關(guān)鍵基因表達(dá)存在一定聯(lián)系，且艾塞