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文檔簡介
1、目的:
了解近年來我院臨床分離肺炎克雷伯菌分布特性和耐藥狀況,分析耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌在體外形成生物膜的能力和特點(diǎn),并探討其生物膜形成的相關(guān)機(jī)制,為有效防治耐藥菌生物膜相關(guān)性感染提供理論依據(jù)。
方法:
1.回顧性調(diào)查2008年~2013年間溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離的肺炎克雷伯菌的臨床分布特征,并分析其對臨床常見藥物的耐藥狀況。
2.耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的最低抑菌濃度(Mininal
2、InhibotoryConcentrations,MICs)檢測:采用瓊脂稀釋法檢測37株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(指對碳青霉烯類藥物亞胺培南、美羅培南、厄他培南中的至少一種藥物表現(xiàn)出不同程度的敏感性下降或者耐藥的菌株)對三種碳青霉烯類藥物具體的MICs,結(jié)果根據(jù)2014年CLSI的標(biāo)準(zhǔn)判讀。
3.CRKP菌株生物膜測定:采用96孔板結(jié)晶紫染色法測定CRKP菌株體外生物膜形成能力。
4.CRKP菌株生物膜形成相關(guān)表型和
3、基因型檢測:采用超粘表型試驗(yàn)和剛果紅試驗(yàn)分析生物膜形成相關(guān)的細(xì)菌生長表型;采用PCR方法擴(kuò)增CRKP菌株中的毒力基因,包括fimH、 mrkD、magA、rmpA、wzy-K2、wzx-K5、wzy-K20、wzx-K54、wzy-K57、wzy-K3;擴(kuò)增并測序分析肺炎克雷伯菌的7個(gè)管家基因,比對數(shù)據(jù)庫獲得菌株具體的ST型別。分析生物膜形成能力與上述各種表型、基因、ST型別的相關(guān)性。
5.測定多粘菌素B對CRKP菌株的MIC
4、值和生物膜最低消除濃度(minimalbiofilm elimination concentrations,MEBC):采用瓊脂稀釋法檢測多粘菌素對CRKP菌株的MIC值;96孔板培養(yǎng)生物膜,用不同濃度的多粘菌素處理預(yù)生成的生物膜,從而獲得具體的MEBC。并比較二者的差異性。
6.外排泵抑制劑CCCP對生物膜形成的影響及外排泵基因的檢測:培養(yǎng)生物膜時(shí)在LB中加入不同濃度梯度的CCCP,分析外排泵抑制劑對生物膜形成是否有抑制或者
5、誘導(dǎo)促進(jìn)的作用;PCR的方法檢測外排泵基因oqxA、oqxB的分布。
7.細(xì)菌不同狀態(tài)下外排泵基因表達(dá)量測定:采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測oqxB在細(xì)菌含/不含亞抑菌濃度CCCP的浮游狀態(tài)下和生物膜狀態(tài)下的表達(dá)差異情況。
結(jié)果:
1.917株肺炎克雷伯菌主要分離自痰液,分離率為50.8%(466/917),其次為血液占16.1%(148/917),尿液占14.4%(132/917),創(chuàng)面占11.2%(1
6、03/917),其他標(biāo)本如膿液、引流液等共占7.4%(68/917);病區(qū)分布主要以ICU科室為主,占40.8%(374/917),其次為神經(jīng)外科和腦外科,共占17.8%(163/917);藥物敏感性結(jié)果顯示:我院肺炎克雷伯菌對氨芐西林的耐藥率接近100%,對呋喃妥因的耐藥率已高達(dá)74%,對包括頭孢曲松、頭孢他啶在內(nèi)的三代頭孢菌素類甚至是酶抑制劑復(fù)合藥物氨芐西林/舒巴坦的耐藥率也都在30%以上,僅對四代頭孢菌素的頭孢吡肟的敏感性較好;對
7、喹諾酮類藥物和氨基糖苷類藥物的總體耐藥水平較接近,處于20%~30%之間;僅對碳青霉烯類藥物亞胺培南的敏感性最好,總體耐藥率僅為4%,但CRKP的分離率在近幾年中呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。
2.CRKP菌株生物膜形成能力高的菌株對碳青霉烯類藥物的耐藥性并不高于生物膜形成能力弱的菌株,甚至是生物膜形成能力較弱的菌株也能對碳青霉烯類藥物表現(xiàn)出很高水平的耐藥;具有超粘特性的菌株、產(chǎn)纖維素的菌株形成生物膜的能力并不比表型試驗(yàn)陰性的菌株強(qiáng)(P
8、=0.582、P=0.865),編碼菌毛的毒力基因缺失的菌株形成生物膜的能力并沒有降低(P=0.381),ST11型別菌株生成生物膜的能力與其他型別相比無明顯差異(P=0.726)。
3.多粘菌素B對試驗(yàn)菌株的MIC值范圍為0.25μg/ml~1μg/ml,都表現(xiàn)為敏感,而MBEC值的范圍為3μg/ml~>12μg/ml,都表現(xiàn)為耐藥。但多粘菌素B對細(xì)菌的MEBC值的大小與細(xì)菌形成生物膜的能力(OD590)并沒有相關(guān)性,即并不
9、是生物膜的形成能力越強(qiáng),MEBC就越高。
4.含亞抑菌濃度CCCP的培養(yǎng)基下培養(yǎng)的生物膜的OD值比不含CCCP培養(yǎng)基培養(yǎng)的生物膜OD值都有不同幅度的提高,即亞抑菌濃度的CCCP對每株菌生物膜的形成能力都表現(xiàn)出不同程度的促進(jìn)作用。另外,外排泵缺失的試驗(yàn)菌株比外排泵基因完整的試驗(yàn)菌株形成生物膜的OD值的水平低。
5.細(xì)菌在生物膜狀態(tài)、含CCCP浮游狀態(tài)及含CCCP生物膜狀態(tài)下外排泵基因oqxB的表達(dá)量均比其在不含CCCP
10、的浮游狀態(tài)下高。
結(jié)論:
1.本院臨床分離的肺炎克雷伯菌標(biāo)本來源主要為痰液,主要分離的科室是ICU,對多種藥物耐藥情況嚴(yán)重,僅對碳青霉烯類藥物保持較好的敏感性,但CRKP菌株也表現(xiàn)出逐年增多的趨勢。
2.CRKP菌株形成生物膜的能力與碳青霉烯類耐藥程度無相關(guān)性。
3.本研究還證明生物膜形成能力與多種毒力因素的表型和基因型無關(guān),且不具有特定的流行分布特點(diǎn)。
4.多粘菌素B對試驗(yàn)菌株生物膜的
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