替加環(huán)素對耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌生物膜作用的初步研究.pdf

1、目的：分析2011-2015年溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離鮑曼不動桿菌的耐藥變化趨勢，研究替加環(huán)素對耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌生物膜的影響，為臨床治療與院感管控提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.回顧分析2011-2015年溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離鮑曼不動桿菌的感染分布及耐藥情況。收集42株非重復(fù)分離的耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌用于后續(xù)研究。
　　2.通過96孔結(jié)晶紫染色法測定臨床分離的42株耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌

2、體外生物膜形成能力。
　　3.通過PCR擴(kuò)增并測序檢測42株耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌中的外排泵基因adeB，adeG，adeM, adeR，adeS, adeJ, adeE，孔蛋白carO和群體感應(yīng)分子abaI基因。
　　4.通過高碘酸鈉(NaIO4)、蛋白酶K和DNA酶分析42株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌體外生物膜的成分。
　　5.通過96孔結(jié)晶紫染色法測定亞抑菌濃度替加環(huán)素(0、1/2、1/4、1/8MIC)作用下42

3、株耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌的體外生物膜形成量。
　　6.通過RT-PCR法測定亞抑菌濃度替加環(huán)素作用下耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌中adeG，adeB，adeJ, adeM, carO和abaI基因相對表達(dá)量，并利用威爾遜相關(guān)性分析生物膜形成量與相關(guān)基因相對表達(dá)量的相關(guān)性。
　　7.應(yīng)用微量肉湯稀釋法測定粘菌素、環(huán)丙沙星、舒巴坦、阿米卡星、美羅培南、替加環(huán)素等6種藥物對耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低生物被膜清除

4、濃度(MBEC)，菌懸液及抗菌藥物溶液的配備參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)2014版執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，其中替加環(huán)素的判讀標(biāo)準(zhǔn)采用歐洲藥敏試驗委員會(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST)。
　　8.通過棋盤稀釋法檢測聯(lián)合用藥效果評價部分抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitoryconcentration index，F(xiàn)

5、ICI)和分級協(xié)同清除濃度指數(shù)(fractional eradication concentrationindex，F(xiàn)ECI)。FICI=MIC藥A聯(lián)用/MIC藥A單用+MIC藥B聯(lián)用/MIC藥B單用，F(xiàn)ECI=MBEC藥A聯(lián)用/MBEC藥A單用+MBEC藥B聯(lián)用/MBEC藥B單用。
　　結(jié)果：
　　1.2011-2015年溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離的669株鮑曼不動桿菌中，分布前三位的病區(qū)分別是重癥監(jiān)護(hù)病區(qū)(ICU+

6、RCU+EICU)，占60.7％，神經(jīng)腦外科，占12.5％及呼吸內(nèi)科，占8.4％，鮑曼不動桿菌對氟喹諾酮類、氨基糖苷類、第三代頭孢菌素類、碳青霉烯類抗菌藥物具有較高的耐藥性，但對替加環(huán)素的耐藥率很低，總體耐藥率＜4.0％。
　　2.用于后續(xù)研究的42株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌對氟喹諾酮類、氨基糖苷類、第三代頭孢菌素類和碳青霉烯類抗菌藥物均耐藥，但均對替加環(huán)素敏感，且均為強(qiáng)生物膜形成株。
　　3.PCR檢測結(jié)果顯示42株耐碳青

7、霉烯類鮑曼不動桿菌均檢出孔蛋白基因carO，群體感應(yīng)分子基因abaI的檢出率為80.0％，外排泵基因adeB, adeG，adeM, adeR, adeS,adeJ的檢出率分別為88.6％，91.4％，88.6％，85.7％，94.3％和94.3％，adeE基因未檢出。
　　4.高碘酸鈉(NaIO4)、蛋白酶K和DnaseⅠ酶對42株強(qiáng)生物膜形成株形成的生物膜均呈現(xiàn)出了不同程度的消除效應(yīng)。高碘酸鈉(NaIO4)對42株耐碳青霉烯類

8、鮑曼不動桿菌生物膜消除效應(yīng)較弱，表現(xiàn)為輕微消除效應(yīng)的占33.3％，表現(xiàn)為極強(qiáng)消除效應(yīng)僅占28.6％，而蛋白酶K、DnaseⅠ對鮑曼不動桿菌生物膜消除效應(yīng)相對較強(qiáng)，表現(xiàn)為極強(qiáng)消除效應(yīng)占比分別高達(dá)90.5％、97.6％。
　　5.亞抑菌濃度替加環(huán)素作用下可顯著抑制耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌生物膜的形成，所有菌株在亞抑菌濃度下的生物膜形成能力均降低。
　　6.生物膜形成量與相關(guān)基因相對表達(dá)量存在一定的相關(guān)性，具體如下:生物膜量和ade

9、G(PCC=0.811,P＜0.01),adeB和adeJ(PCC=0.615,P＜0.05),adeB和adeM(PCC=0.573,P＜0.05),adeJ和adeM(PCC=0.777,P＜0.01),adeJ和carO(PCC=0.741,P＜0.01),carO和adeM(PCC=0.938,P＜0.01),abaI和adeB(PCC=0.701,P＜0.01),abaI和adeJ(PCC=0.574,P＜0.05)。

10、　　7.替加環(huán)素分別聯(lián)合粘菌素、環(huán)丙沙星、舒巴坦、美羅培南、阿米卡星后產(chǎn)生協(xié)同抑菌效應(yīng)時，替加環(huán)素聯(lián)合后最低抑菌濃度較單藥最低抑菌濃度下降程度顯著高于其他抗菌藥物下降程度;替加環(huán)素與4種抗菌藥物（除外阿米卡星）聯(lián)合后協(xié)同抑菌率較低，大部分表現(xiàn)為不相關(guān)，全部組合中均未發(fā)現(xiàn)拮抗現(xiàn)象。
　　8.替加環(huán)素、美羅培南、阿米卡星、環(huán)丙沙星、粘菌素、舒巴坦對耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌MIC與MBEC值相比下降4～1024個倍比稀釋倍數(shù)不等，而替加環(huán)

11、素的下降程度顯著高于其他5種抗菌藥物;替加環(huán)素與4種抗菌藥物（除外阿米卡星）聯(lián)合后協(xié)同清除率較低，大部分表現(xiàn)為不相關(guān)，全部組合中均未發(fā)現(xiàn)拮抗現(xiàn)象。而替加環(huán)素與阿米卡星聯(lián)合的MEBC因阿米卡星的MEBC＞100000μg/ml，體外藥物濃度無法達(dá)到更高濃度而無法得到完整的數(shù)據(jù)。
　　結(jié)論：
　　1.本研究中2011-2015年間溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離的鮑曼不動桿菌標(biāo)本來源主要來自于痰，主要分離的科室為ICU，對臨床常

12、用的多種抗菌藥物（包括碳青霉烯類）耐藥情況嚴(yán)重，但對替加環(huán)素抗菌藥物敏感性較好。
　　2.本研究中耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌多重耐藥情況嚴(yán)重，不乏泛耐藥菌株，且生物膜形成能力較強(qiáng)，外排泵相關(guān)基因陽性率均較高。
　　3.本研究中耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌所形成生物膜的主要成分是多糖、蛋白質(zhì)、DNA，高碘酸鈉(NaIO4)、蛋白酶K和DnaseⅠ酶對強(qiáng)生物膜形成株形成的生物膜呈現(xiàn)出了不同程度的消除效應(yīng)。
　　4.替加環(huán)素在亞抑菌濃

13、度下可顯著抑制耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌生物膜的形成，所有菌株在亞抑菌濃度下的生物膜形成能力均降低。并且在不同亞抑菌濃度替加環(huán)素作用下，耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌生物膜生成量有所不同，菌株間存在個體差異性，且其抑制比例也存在差異，提示亞抑菌濃度替加環(huán)素對耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌生物膜的抑制機(jī)制復(fù)雜，具體有待進(jìn)一步研究。
　　5.本研究中亞抑菌濃度替加環(huán)素作用下耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌生物膜形成量與adeG，adeB，adeJ, adeM, c

14、arO和abaI基因相對表達(dá)量具有明顯的相關(guān)性。
　　6.本研究中耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌在替加環(huán)素與除阿米卡星以外的美羅培南、環(huán)丙沙星、粘菌素、舒巴坦等4種抗菌藥物聯(lián)合作用后協(xié)同抑菌率較低，大部分表現(xiàn)為不相關(guān)，而替加環(huán)素對耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌MIC與MBEC值比較的下降程度顯著高于阿米卡星、美羅培南、環(huán)丙沙星、粘菌素、舒巴坦等5種抗菌藥物的下降程度。
　　7.耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌耐藥情況十分嚴(yán)峻，應(yīng)引起臨床醫(yī)生的高度重視