2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、3-羥基丙酸(3-hydroxypropionic acid,3-HP)因其優(yōu)良的性質(zhì)和廣泛的應(yīng)用前景,被美國能源部列為全球12大最具潛力的化工產(chǎn)品之一。但目前生物法合成3-HP最主要的問題其產(chǎn)量較低,因此開發(fā)優(yōu)良的基因工程菌株是目前的主要研究方向。本研究以大腸桿菌(E.coli W3110)為出發(fā)菌株,構(gòu)建了3-HP的合成代謝途徑,并在途徑中敲除了副產(chǎn)物合成的相關(guān)途徑,并引入輔酶再生途徑,構(gòu)建了優(yōu)良的3-HP合成工程菌,并對工程菌生產(chǎn)

2、3-HP的能力進行了探索,具體研究內(nèi)容如下:
 ?。?)克隆來源于K.pneumoniae DSM2026甘油脫水酶基因dhaB及甘油激活因子基因gdrA,得到重組質(zhì)粒pACYCDuet-tac-dhaB1-4質(zhì)粒和pTrc99a-dhaB1-4質(zhì)粒;利用MBTH方法檢測甘油脫水酶酶活,測得E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-tac-dhaB1-4甘油脫水酶酶活為2.00 U/mL,比酶活為8.94 U/mg;E

3、.coli BL21(DE3)/pTrc99a-dhaB1-4甘油脫水酶酶活為2.14 U/mL,比酶活為9.59 U/mg??寺嶒炇仪捌谕蛔兊陌臀鞴痰菥?A.brasilense)的內(nèi)源性基因α-酮戊二酸半醛脫氫酶基因TUkgsadh,得到重組質(zhì)粒pCDFDuet-tac-TUkgsadh;測得E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-tac-TUkgsadh酶活為0.68 U/mL,比酶活為3.11 U/mg。通過化學(xué)

4、轉(zhuǎn)化法,得到重組菌E.coli BL21(DE3)(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)和E.coli BL21(DE3)(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pTrc99a-dhaB1-4)。上述菌株好氧發(fā)酵35小時后,3-HP的最高產(chǎn)量分別為1.09 g/L和0.41 g/L。
 ?。?)克隆釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的甘油-3-磷

5、酸脫氫酶基因gpd1和大腸桿菌中細胞膜上轉(zhuǎn)運蛋白—吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因sthA。在重組質(zhì)粒pCDFDuet-tac-TUkgsadh基礎(chǔ)上,構(gòu)建了輔酶再生的串聯(lián)重組質(zhì)粒pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh和pCDFDuet-tac-sthA-TUkgsadh。結(jié)果表明以乙醛為底物時,E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh和E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-

6、tac-sthA-TUkgsadh的醛脫氫酶的比酶活是E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-tac-TUkgsadh的2.04倍和3.03倍,說明輔酶再生基因的表達有利于提高醛脫氫酶的活性。
 ?。?)敲除形成副產(chǎn)物1,3-PDO的主要酶基因—乙醛脫氫酶基因yqhD,得到E.coli W3110_?yqhD(pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4),該工程菌搖

7、瓶微好氧發(fā)酵35小時,3-HP產(chǎn)量達到4.46g/L,相比未敲除yqhD基因的菌株,其3-HP產(chǎn)量提高了9.42倍。敲除了甘油代謝途徑中的抑制因子glpR基因,得到E.coli W3110_?glpR(pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4),該工程菌搖瓶微好氧發(fā)酵35小時,3-HP產(chǎn)量達到4.02g/L,相比未敲除glpR基因的菌株,其3-HP產(chǎn)量提高了8.40倍。
  

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