全局?jǐn)_動(dòng)和同源重組策略生產(chǎn)3-羥基丙酸.pdf

1、3-羥基丙酸(3-hydroxypropionicacid，3-HP)是一種重要的平臺(tái)C3化合物，利用微生物生產(chǎn)3-HP是目前研究的熱點(diǎn)。本論文以高效利用甘油的肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae）為宿主菌，采用分子生物學(xué)手段，從以下三個(gè)方面構(gòu)建了3-HP的高產(chǎn)菌株，并對(duì)高產(chǎn)菌株生產(chǎn)3-HP進(jìn)行了初步研究。
　　 1、本研究首次采用全局轉(zhuǎn)錄機(jī)器工程(gTME)的策略，利用易錯(cuò)PCR技術(shù)構(gòu)建K.pneumoni

2、ae關(guān)鍵元件首要σ因子基因rpoD的突變文庫(kù)，連接至表達(dá)載體pET-PK，電轉(zhuǎn)化K.pneumoniaeDSM2026，從大量陽(yáng)性克隆中篩選出一株3-HP高產(chǎn)菌K.p(pET-PK-mrpoD)。初步發(fā)酵試驗(yàn)表明，該攜帶突變r(jià)poD基因的重組菌能高效利用甘油生產(chǎn)3-HP，產(chǎn)量達(dá)到4.49g/L，比攜帶野生型rpoD基因的對(duì)照菌提高242.75％，甘油轉(zhuǎn)化率、生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了832.50％、239.39％。
　　 2、本研究克隆

3、了來(lái)自于大腸桿菌（Escherichiacoli的醛脫氫酶基因aldH，連接至表達(dá)載體pET-PK，電轉(zhuǎn)化K.pneumoniaeDSM2026，得到重組菌K.p(pET-PK-aldH)。試驗(yàn)表明，基因aldH成功表達(dá)，K.p(pET-PK-aldH)的3-HP產(chǎn)量達(dá)到2.96g/L，比對(duì)照菌Kp(pET-PK)提高了1.5倍，生產(chǎn)強(qiáng)度提高57.36％。
　　 3、本研究首次采用同源重組策略，設(shè)計(jì)了以基因aldH為核心的同源重

4、組片段，利用K.pneumoniae自身的RecA同源重組系統(tǒng)，將同源重組片段轉(zhuǎn)換到K.pneumoniae染色體的IS1位置，構(gòu)建了重組菌KpAD。試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)換至染色體上的基因aldH成功表達(dá)，KpAD/Kan+的3-HP產(chǎn)量達(dá)到0.84g/L，KpAD/Kan-的3-HP產(chǎn)量達(dá)到了0.90g/L，分別是對(duì)照菌產(chǎn)量0.60g/L的1.4、1.5倍，KpAD/Kan-的甘油轉(zhuǎn)化率、生產(chǎn)強(qiáng)度是對(duì)照菌的1.7、1.5倍，KpAD/Kan+