蛇根木Perakine還原酶及其突變體的表達(dá)、酶特征、結(jié)晶及復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、夾竹桃科蘿芙木屬藥用植物蛇根木(RauvolfiascrpentinaBenth.exKurz),富含生物堿類化合物,具有降血壓、抗心律失常、退熱、抗癲、治蟲蛇咬傷等功效,其主要活性成分為阿嗎靈、阿嗎堿和利血平.對其次生代謝產(chǎn)物生物合成網(wǎng)絡(luò)的研究是進(jìn)一步開發(fā)利用該藥用植物,調(diào)控生物代謝方向,體外表達(dá)其活性成分的基礎(chǔ)。本論文對催化蛇根木生物堿Perakine還原為Raucaffrinoline反應(yīng)的Perakine還原酶(Perakine

2、Reductase,PR)進(jìn)行了主要包括該酶的表達(dá)、突變、結(jié)晶及其與輔酶的三維結(jié)構(gòu)的研究。
　　 課題組在前期的研究中對Perakine還原酶的生物化學(xué)特征進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)PR為特異性依賴NADPH為輔酶進(jìn)行氧化還原反應(yīng),通過序列比對和基因突變證明醛酮還原酶(Aldo-KetoReductase,AKR)超家族的新成員,而且其底物特異性相對較低。本文的第一部分對甲基化后Perakine還原酶及其突變體進(jìn)行了生物化學(xué)研究。以pQE

3、-2質(zhì)粒為表達(dá)載體,在大腸桿菌M15中異源高效表達(dá)N端帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)記的PR,并利用Ni-NTA親和層析進(jìn)行純化。為得到復(fù)合物晶體,對Perakine還原酶進(jìn)行突變,并確定其生化性質(zhì)。
　　 為進(jìn)一步深入研究Perakine還原酶的三維結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)構(gòu)造及催化機(jī)制,論文的第二部分對Perakine還原酶及酶與輔酶/底物復(fù)合物進(jìn)行了結(jié)晶條件的摸索及X-ray三維結(jié)構(gòu)的分析。經(jīng)賴氨酸殘基甲基化修飾后,(His)6-PR采用氣相擴(kuò)散

4、懸滴法進(jìn)行結(jié)晶,優(yōu)化后的結(jié)晶條件為:晶體生長溫度為20℃,酶的濃度在4.5-5.0mg/ml之間,以pH7.0的0.1M檸檬酸鈉為結(jié)晶緩沖液,27％PEG4000為沉淀劑。所得甲基化(His)6.PR晶體為正交晶系,屬于C2221空間群,晶胞參數(shù)為a=58.796(A),b=93.042(A),c=142.997(A),α=β=γ=90,每個(gè)不對稱單元中包含一個(gè)酶分子。對Perakine還原酶突變體和NADPH進(jìn)行共結(jié)晶,得到晶體為屬于