AHAS酶突變體系的建立及其研究.pdf

1、由于不斷地向植物中是施加除草劑或是作用機理相同的除草劑的反復使用，導致雜草種群對除草劑產生了抗藥性，給防治和生產管理增加了難度。從大量所研究的高等植物的抗性生物型中所得到的AHAS酶基因序列表明，一般來說，存在五個不連續(xù)的高度保留的抗性區(qū)域，這些區(qū)域中的氨基酸置換可能會產生抗性，這些突變使AHAS酶對除草劑的抑制作用不敏感。除了實驗室的篩選外，所有雜草中建立在靶標基礎上的對AHAS酶抑制劑的抗性都是由這五個保留區(qū)中任意某個基因突變所引起

2、的。 為了找到雜草中建立在靶標AHAS酶基礎上的對AHAS酶抑制劑的抗性根源，開發(fā)出新的農藥體系克服雜草的抗藥性，我們利用Megaprimer PCR基因定點突變技術，在E.coli AHAS Ⅱ酶的五個不連續(xù)高度保留區(qū)域A-E區(qū)中分別引入了W464A、W464F、W464L、W464Q、W464Y；M460A、M460F、M460L、M460Q、M460N；A108L、A108Q；V99L、V99Y；A26L、A26P、A26

3、Q、A26Y基因點突變。通過PCR電泳分析、重組質粒的雙酶切分析及測序鑒定，確證構建成功了十八個Ecoli AHAS Ⅱ酶突變體。通過對E.coli AHAS Ⅱ野生型及突變酶動力學性質的測定可以發(fā)現(xiàn)它們對于底物(pyruvate)及三種輔助因子(FAD、ThDP、Mg<'2+>)有著截然不同的特征常數(shù)，這些位點上氨基酸的突變很可能引起了AHAS酶局部構象的改變，構象上的改變導致了與三種輔助因子特征常數(shù)的上的差異。 此外，也通過

4、E.coli AHAS Ⅱ野生型及突變酶對兩種咪唑啉酮類除草劑和11種磺酰脲類除草劑敏感性的研究，比較不同的突變酶對于同種除草劑敏感性的差別。研究發(fā)現(xiàn)不同的突變體對不同結構的抑制劑敏感性是不一樣的，對所測試的磺酰脲和咪唑啉酮除草劑都表現(xiàn)出抗性。這可能是由于除草劑結合在野生型的AHAS酶的底物進出的通道處，和這個通道上的氨基酸側鏈形成了很強的相互作用，因為除草劑阻止了底物的進出，所以AHAS酶的活性就受到了抑制；但是如果這個通道處的某個氨