短乳桿菌甘油脫水酶及1,3-丙二醇氧化還原酶基因的協(xié)同表達(dá)與甘油轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、具有雙官能團(tuán)的1，3-丙二醇(1，3-propanediol，1，3-PD)的一個(gè)最有前途的特性是可以用于合成聚醚、聚酯和聚亞氨酯等縮聚物，并廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品和化工等領(lǐng)域，在國(guó)際上供不應(yīng)求。近年來(lái)隨著“綠色”生產(chǎn)觀念的深入，生物法生產(chǎn)1，3-PD更符合可持續(xù)發(fā)展的理念，逐漸成為各國(guó)學(xué)者開(kāi)展研究的重點(diǎn)。甘油脫水酶(glycerol dehydratase，GDHt)和1，3-丙二醇氧化還原酶(1，3-propanediol d

2、ehydrogenase，PDOR)作為1，3-PD生物合成途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶，在甘油轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1，3-PD的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。因此構(gòu)建高性能的基因工程菌，對(duì)于1，3-PD生產(chǎn)效率的提高以及工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的意義。
　　本論文利用PCR技術(shù)從短乳桿菌（Lactobacillus brevis）中擴(kuò)增出PDOR的編碼基因dhaT，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSE-dhaT,并在大腸桿菌(Escherichia coli) JM109中

3、得到了高效表達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示重組菌JM109-dhaT有43 kDa特異性蛋白條帶出現(xiàn)。經(jīng)過(guò)金屬鎳親和層析及Sephacryl S-300凝膠層析純化后，系統(tǒng)地測(cè)定其酶學(xué)性質(zhì)。當(dāng)以1，3-PD為底物時(shí)，重組酶氧化反應(yīng)的最適溫度為25℃，最適pH為10.0，氧化反應(yīng)的比活為32.6 U/mg，對(duì)1，3-PD的Km值為2.28 mmol/L，Vmax為35.62μmol/min/mg;當(dāng)以丙醛為底物時(shí)，還原反應(yīng)的最適溫度為3

4、7℃，最適pH為8.0，比活為38.7 U/mg，對(duì)丙醛的Km值為1.53 mmol/L，Vmax為42.77μmol/min/mg。
　　同時(shí)克隆并表達(dá)了L.brevis GDHt的編碼基因dhaBCE，構(gòu)建重組菌Rosetta(DE3)-dhaBCE;dhaBCE表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析顯示有66 kDa（大亞基）、27 kDa（中亞基）、20 kDa（小亞基）特異性蛋白條帶出現(xiàn)，純化蛋白并測(cè)定其酶學(xué)性質(zhì)，該酶的最適反應(yīng)

5、溫度為37℃，最適pH為8.5;比活力為25.2 U/mg;其對(duì)1，2-丙二醇、甘油和CoB12的Km分別為5.45 mmol/L、3.72 mmol/L和2.11μmol/L，Vmax分別為34.6μmol/min/mg、45.7μmol/min/mg和54.3μmol/min/mg。
　　利用重組質(zhì)粒pSE-dhaT和pSE-dhaBCE構(gòu)建基因工程菌Rosetta(DE3)-dhaTBCE，實(shí)現(xiàn)了dhaT和dhaBCE基因的