Klebsiella pneumoniae甘油脫水酶的分子改造研究.pdf

1、本論文通過(guò)理性設(shè)計(jì)進(jìn)化的方法(定點(diǎn)突變、飽和突變和多點(diǎn)聯(lián)合突變)研究酶的活性中心位點(diǎn)和保守區(qū)域位點(diǎn)的突變對(duì)酶活力的影響，為對(duì)甘油脫水酶分子的進(jìn)一步改造提供理論依據(jù)。
　　 以PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中與本實(shí)驗(yàn)中K. pneumoniae甘油脫水酶同源性最高的甘油脫水酶的三維結(jié)構(gòu)分子(PDB liwp)為模板，利用Swissmodel進(jìn)行同源建模，同時(shí)利用prosa2003能量分析軟件對(duì)相應(yīng)氨基酸的替換進(jìn)行能量分析，分析結(jié)果顯示有17個(gè)突變酶

2、的能量相對(duì)于原始酶降低，另外11個(gè)突變酶的能量則相對(duì)于原始酶升高。
　　 以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的整合有肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)甘油脫水酶基因的重組質(zhì)粒pSE380—gldABC為模板，利用反向PCR對(duì)該基因進(jìn)行理性分子改造，共獲得28個(gè)突變子，對(duì)帶有突變質(zhì)粒的大腸桿菌工程菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)鎳離子親和層析與Sephacryl S300凝膠層析純化后，SDS—PAGE分析顯示出均一的三條特異性蛋白質(zhì)表達(dá)

3、條帶。測(cè)定純化后獲得的突變酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果顯示：在28個(gè)突變酶中，有5個(gè)突變酶在甘油和1，2—丙二醇兩種底物條件下均無(wú)酶活，以甘油為底物時(shí)，酶活力得到提高的突變酶有18個(gè)，其中T234S、A119E、1498N+Q42S+Y525W和D58Y+F60Y的比活分別提高至原始酶的5.99、5.46、5.09和4.83倍；以1，2—丙二醇為底物時(shí)，酶活力得到提高的有17個(gè)，其中，T234S、Y525F、A119E和Y525F+D58Y的比活