以甘油為底物產(chǎn)二羥丙酮（DHA）微生物的選育及甘油脫氫酶酶學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、二羥丙酮(DHA)是一種重要的化工原料，在精細(xì)化工、制藥、食品等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究從自然界篩選出21株能夠以甘油為唯一碳源產(chǎn)二羥丙酮的菌株，經(jīng)初步發(fā)酵測(cè)定發(fā)酵液中DHA含量，其中菌株6-8DHA產(chǎn)量最高達(dá)6.2g/L。對(duì)其進(jìn)行常規(guī)生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合16SrDNA基因分析，比對(duì)結(jié)果表明，菌株6-8與Acinetobactersp.B8-22相似性最高，達(dá)99.7％，在細(xì)菌分類(lèi)學(xué)上屬于假單胞菌目莫拉菌科不動(dòng)桿菌屬，將其命名

2、為Acinetobactersp.6-8。在研究Acinetobactersp.6-8在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線的基礎(chǔ)上，考察了培養(yǎng)時(shí)間與培養(yǎng)溫度對(duì)Acinetobactersp.6-8發(fā)酵DHA的影響，最終確定37℃時(shí)發(fā)酵72h即可獲得較高的DHA產(chǎn)量。在搖瓶水平上，分別考察了碳源和氮源對(duì)Acinetobactersp.6-8發(fā)酵產(chǎn)DHA的影響，并對(duì)碳氮源綜合水平進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，最終確定采用甘油10.0％、山梨醇2.0％、酵母膏0.

3、5％、玉米漿0.2％作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮源濃度，以此條件發(fā)酵，DHA產(chǎn)量為7.21g/L，比未優(yōu)化時(shí)DHA產(chǎn)量提高了9.8％； 建立了簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確測(cè)定二羥丙酮(DHA)的高效液相色譜(HPLC)方法，以AlltimaC18(5μm，250×4.6mm)為分離柱，5％甲醇水溶液(0.05％H3PO4調(diào)pH至3.0)為流動(dòng)相，用紫外檢測(cè)器在203nm處檢測(cè)DHA。結(jié)果測(cè)得DHA標(biāo)準(zhǔn)樣品在203nm的保留時(shí)間為6.2min，并測(cè)得DHA

4、的線性范圍為0.1～10.0g/L，用HPLC法測(cè)得以甘油為底物發(fā)酵產(chǎn)DHA發(fā)酵液中DHA含量與顯色法測(cè)得的DHA含量一致。 以克雷伯氏菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到編碼甘油脫氫酶(GDH)基因dhaD，將其克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a(+)上，在E.coliBL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，利用表達(dá)載體pET-28a(+)上的6-His-Tag標(biāo)記選用Ni2+柱純化具有表達(dá)活性的甘油脫氫酶(GDH)，純化后比酶活達(dá)到156

5、U/mg，純化倍數(shù)達(dá)4.6倍，回收率為67.4％。并初步研究了該酶的酶學(xué)性質(zhì)：酶反應(yīng)的最適pH為11.0，在pH7.0～12.0范圍內(nèi)穩(wěn)定；酶反應(yīng)的最適溫度為30℃，穩(wěn)定范圍為25℃～45℃；Mg2+、Cu2+、Zn2+、K+對(duì)酶促反應(yīng)有一定的激活作用；酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)以甘油為底物的Km為0.54mmol/L，Vmax為0.49μmol/(mL·min)，說(shuō)明了此酶對(duì)甘油的親和性較高。本實(shí)驗(yàn)采用了生物全細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法，將重組大腸桿菌培養(yǎng)至對(duì)