靈芝三磷酸甘油醛脫氫酶基因的克隆及轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建.pdf

1、靈芝[(Oanoderma lucidum(Leyss.ex.Fr.)Karst)]屬于真菌界(Mycota),擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina),多孔菌目(Aphyllophprates),靈芝菌科(Ganodermataceae),是我國著名的藥用真菌,具有重要的藥理作用,作為藥物已經(jīng)有2000多年的歷史。三萜類化合物是靈芝的重要藥用成分,具有保肝、抗腫瘤、抑制組織胺釋放、抑制膽固醇的合成和吸收以及抗HIV和抗HIV蛋白酶

2、的作用等功能。因此,靈芝中三萜含量的高低已經(jīng)成為靈芝質(zhì)量高低的重要指標(biāo)。 目前要通過分子生物學(xué)技術(shù)培育優(yōu)良的靈芝菌株、提高靈芝菌株的藥用價(jià)值,就必須構(gòu)建靈芝的高效表達(dá)載體。在一些報(bào)道的其他真菌中,提高轉(zhuǎn)化效率的一種方法就是使用同源強(qiáng)啟動(dòng)子,而在靈芝中,就目前為止,還沒有這樣的啟動(dòng)子被報(bào)道。在釀酒酵母中,三磷酸甘油醛脫氫酶被報(bào)道是大量表達(dá)的,在酵母中,gpd基因占總mRNA 2％-5％,因此三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)

3、子,而且在很多不同的真菌中,gpd基因啟動(dòng)子已經(jīng)被成功地用來構(gòu)建轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。 根據(jù)已報(bào)道的GPD氨基酸序列,針對(duì)GPD的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物,以靈芝基因組DNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增,獲得一個(gè)長624bp的靈芝三磷酸甘油醛脫氫酶基因特異DNA片段。利用已經(jīng)獲得的靈芝gpd基因特異片段,設(shè)計(jì)-對(duì)專一引物,結(jié)合cDNA文庫兩臂的通用引物,分別擴(kuò)增得到靈芝gpd基因的5'和3'端DNA片段,根據(jù)基因的5'和3'端DNA序列設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增靈

4、芝的cDNA文庫,得到靈芝gpd基因的全長cDNA序列,該序列全長1014bp,編碼337個(gè)氨基酸。將靈芝gpd基因全長cDNA序列進(jìn)行Blast分析,發(fā)現(xiàn)與基因具有較高同源性的物種是Pycnoporus coccineus。根據(jù)基因的5'和3'端DNA序列設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增靈芝的基因組DNA,得到靈芝gpd基因的全長基因組序列,該序列全長1401bp。靈芝gpd基因中,由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。對(duì)靈芝gpd基因進(jìn)行一系列生物信息學(xué)分析

5、,發(fā)現(xiàn)gpd基因內(nèi)存在1個(gè)保守的活性位點(diǎn),利用Chust X和PUAP4.0建了靈芝gpd基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)其與真菌界中擔(dān)子菌親緣關(guān)系最為密切,進(jìn)化關(guān)系符合經(jīng)典的物種分類的結(jié)果。通過RT-PCR的方法,證實(shí)了在靈芝中,gpd基因表達(dá)量很大。 根據(jù)靈芝gpd基因組DNA序列,設(shè)計(jì)引物,以總基因組DNA為模板,采用TaKaRaLAPCR(TM) in vitro Cloning Kit試劑盒擴(kuò)增了其上游啟動(dòng)子序列,該序列長約1.

6、2Kb,使用了啟動(dòng)子分析軟件,在5'的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)可能的啟動(dòng)子區(qū)域,啟動(dòng)子區(qū)域包含有2個(gè)CAAT boxes(CCAAT),還有一個(gè)TATA box(TATAAAA),沒有發(fā)現(xiàn)在A。nidulans and A.niger gpd gene中發(fā)現(xiàn)的gpd,pgk,qut,and qa boxes。 以pCAMBIA-1300質(zhì)粒為母板,構(gòu)建雙元載體GLP-1300,PCR擴(kuò)增潮霉素基因以及煙草花葉病毒35S終止子,然后將