西伯利亞蓼3-磷酸甘油醛脫氫酶的cDNA克隆及耐鹽性分析.pdf

1、本研究根據(jù)NaHCO3脅迫下的西伯利亞蓼(Polygonum sibiricum Laxm.)消減文庫中的ETS序列，利用RACE技術(shù)，克隆出3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的全長cDNA序列，命名為Ps GAPDH。通過生物信息學(xué)方法進行了初步的分析;利用Northern雜交技術(shù)對NaHCO3不同脅迫時間下的地下莖、莖及葉的表達模式進行研究;將該基因構(gòu)建到釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，INVScI)表達

2、載體pYES2，進行釀酒酵母的遺傳轉(zhuǎn)化，對轉(zhuǎn)基因酵母的耐鹽性進行了研究。主要實驗結(jié)果如下：
　　(1) Ps GAPDH cDNA序列全長1331bp，完整閱讀框1014bp，編碼337個氨基酸。氨基酸序列分子量為36.672 kDa，理論pI值是7.66，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)是24.31，屬于穩(wěn)定蛋白。氨基酸同源性比對顯示草本植物西伯利亞蓼的GAPDH與其它草本植物的GAPDH基因同源序列相似性較高，最高達到96％;與落葉灌木也具有高

3、的同源性，最高達到93％;且它與其它物種中存在于細胞質(zhì)的GAPDH基因的氨基酸序列同源性高達96％。推測此基因?qū)儆诎|(zhì)中的GAPDH基因。蛋白比對顯示該基因編碼蛋白有2個保守的功能域，一個為行使糖運輸和代謝的GAPDH功能域;另一個是NAD(P)結(jié)合功能域。
　　(2) Northern印記雜交檢測顯示，NaHCO3脅迫處理的西伯利亞蓼的地下莖、莖及葉片具有不同的表達模式。在葉部脅迫4-24 h過程中，Ps GAPDH表達減少，表

4、現(xiàn)受抑制，48 h后趨于正常。而在莖部在2-8 h，隨著脅迫時間的增加表達量增加，表現(xiàn)為誘導(dǎo)，而隨后的24-48h脅迫后表達量趨于正常。而在地下莖中，Ps GAPDH的表達量有微弱的增強。
　　(3)將Ps GAPDH基因與酵母表達載體pYES2連接，獲得了pYES-GAPDH重組質(zhì)粒。將pYES-GAPDH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母菌INVScI中。隨機挑選3個INVScI(pYES-GAPDH)單菌落，經(jīng)PCR擴增和提取菌液質(zhì)粒雙酶切證明

5、Ps GAPDH基因已構(gòu)建到pYES2載體上;對INVScI(pYES-GAPDH)和INVScI(pYES2)菌株進行半乳糖誘導(dǎo)，RT-PCR證明該基因已經(jīng)在酵母中成功表達，對轉(zhuǎn)基因酵母進行NaHCO3和NaCl脅迫。結(jié)果表明，INVScI(pYES-GAPDH)重組酵母與INVScI(pYES2)相比，在10％ NaHCO3和4mol·L-1 NaCl脅迫下具有較高的存活率。說明，來源于西伯利亞蓼的GAPDH基因賦予酵母細胞一定的抗