西伯利亞蓼（Polygonum sibiricum）rd22基因的克隆、表達與功能驗證.pdf

1、本研究利用RACE技術，從鹽生植物——西伯利亞蓼中克隆了rd22基因(GenBank accession no.DQ836050)的cDNA序列，對該基因的生物信息學顯示，rd22 eDNA基因cDNA全長1302bp，其中開放讀碼框(ORF)為1218bp，編碼405個氨基酸組成的蛋白。該蛋白是一個堿性的分泌蛋白，預測分子量為43.0kD，理論等電點為．9.47。RD22蛋白序列N端前21個氨基酸具有較強的疏水性，被預測為信號肽結構，

2、對d22基因編碼的氨基酸序列進行同源分析，發(fā)現序列的C端存在一個保守的結構域。d22基因編碼的蛋白屬于BURP蛋白家族，其具有共同的結構特征：(1)N端疏水區(qū)； (2)短保守片段；(3)包含重復序列區(qū)域；(4)保守的BURP結構域。 利用Northern雜交技術，對所克隆的rd22基因在鹽脅迫下西伯利亞蓼各組織中的表達特性進行了研究。結果顯示，西伯利亞蓼rd22基因在不同組織中表達模式具有時空多樣性，在地下莖中不表達，在

3、莖中大量表達但不受鹽誘導，在葉中卻受鹽誘導。 rd22基因編碼的氨基酸序列中含有一個保守的BURP結構域，但其功能也是未知的。為驗證rd22基因和編碼BURP結構域的序列是否具有耐鹽功能，將二者測序驗證后連入植物表達載體pROKII，構建了兩個重組質粒pROK-rd22、pROK-burp。通過農桿菌介導法轉化煙草，經卡那抗性篩選，共獲得了84株抗性植株。選擇部分轉化株系進行PCR檢測和Northern雜交分析，證明了外源基因已

4、整合到煙草基因組中，除了一個株系外，都得到了轉錄水平的表達。分別選擇4個轉rd22煙草株系和4個轉burp煙草株系進行耐鹽堿試驗，結果表明，200retool·L<'-1>NaCl脅迫下轉基因株系的根生長狀況要好于非轉基因株系；5retool·L<'-1>NaHCO<,3>脅迫下，野生型煙草與轉基因煙草生長狀況差異不顯著。因此，轉基因煙草對中性鹽的耐受力較好，強于堿性鹽。對各株系進行了MDA含量及SOD、POD活性測定，200mmol·

5、L<'-1>NaCI脅迫下轉基因株系的MDA含量低于非轉基因株系，POD活性高于非轉基因株系，但SOD活性無顯著差異；5mmol·L<'-1>NaHCO<,3>脅迫下，各轉化株系的三個生理指標與對照株系比未見顯著差異。說明兩個外源基因的轉化使煙草的耐鹽能力稍有提高，但增幅不顯著；對耐堿能力沒有太大增加。因此，西伯利亞蓼的rd22基因及編碼其BURP結構域的序列對煙草的轉化沒能提高轉基因煙草組培苗對鹽堿的抗性。西伯利亞蓼的rd22基因及編