西伯利亞蓼PsPGIP基因的克隆及功能分析.pdf

1、多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(poly galacturonase inhibiting protein,PGIP)是一種能夠特異性結(jié)合和抑制真菌內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)活性的細胞壁結(jié)合蛋白,在國內(nèi)外已在多種單雙子葉植物中發(fā)現(xiàn)了多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白,本文根據(jù)西伯利亞蓼莖抑制消減文庫(SSH)中獲得的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Poly galaeturonase inhibiting proteins)EST序列,采用RAC

2、E技術(shù)在西伯利亞蓼消減庫(SSH)成功克隆了多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(PsPGIP)的cDNA序列,利用生物信息學(xué)技術(shù)對該基因的序列進行分析。采用實時定量PCR技術(shù)分析PsPGIP基因在3％NaHCO3脅迫下葉、莖、地下莖表達量的差異性。同時構(gòu)建PsPGIP基因的植物表達載體,并轉(zhuǎn)入到煙草中,進一步分析非轉(zhuǎn)基因煙草和PsPGIP基因的過量表達在鹽脅迫下丙二醛(MDA)含量,SOD、POD活性及可溶性蛋白含量的變化情況以及在不同真菌侵

3、害時葉片受傷害的程度分析,為進一步的抗病育種工作提供理論實踐經(jīng)驗。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、PsPGIP基因的克隆及鹽脅迫下的表達分析
　　 成功克隆PsPGIP全長eDNA序列(ACD01043),全長1251bp,生物信息學(xué)分析表明,開放讀碼框為1020 bp,編碼339個氨基酸,具有一段24個殘基的保守亮氨酸結(jié)構(gòu)域。該基因具有N端信號肽,具有PGIPs基因家族共有的典型保守區(qū)域,屬PGIPs家族基因。熒光定量P

4、CR分析表明,PsPGIP在西伯利亞蓼葉、莖、地下莖等器官中均有分布。在3％NaHCO3誘導(dǎo)表達中,該基因在葉中表達明顯受鹽脅迫的誘導(dǎo)。
　　 2、PsPGIP基因?qū)煵莸倪z傳轉(zhuǎn)化及抗性分析
　　 (1)構(gòu)建PsPGIP基因的植物表達載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將PsPGIP基因轉(zhuǎn)入煙草植株中,并利用PCR和RT-PCR等方法驗證PsPGIP基因已經(jīng)在煙草中成功表達。
　　 (2)選取6個轉(zhuǎn)基因株系進行鹽脅迫試驗,分析

5、逆境脅迫條件下非轉(zhuǎn)基因野生型煙草和轉(zhuǎn)PsPGIP基因煙草的丙二醛(MDA)含量、SOD活性、POD活性以及可溶性蛋白含量的變化。結(jié)果表明,在100 mmol/L,NaCl脅迫下,多數(shù)轉(zhuǎn)基因株系的POD活性、可溶性蛋白、SOD含量比非轉(zhuǎn)基因野生型煙草高,而MDA含量低于非轉(zhuǎn)基因野生型煙草。說明在鹽脅迫條件下,轉(zhuǎn)PsPGIP基因煙草在抵御鹽傷害上明顯強于非轉(zhuǎn)基因煙草。
　　 (3)進一步分析6個轉(zhuǎn)基因株系抵御真菌傷害方面的差異。結(jié)果