鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶同工酶基因的克隆、功能及產(chǎn)生機制研究.pdf

1、鹽生杜氏藻(Dunaliella salina，簡稱鹽藻)是一種迄今為止發(fā)現(xiàn)的世界上最耐鹽的真核光合生物，可以在0.3％到飽和鹽濃度的范圍內(nèi)生長。鹽藻是單細胞綠藻，沒有細胞壁，生長快，是一種很好的研究鹽脅迫和滲透脅迫的模式物種。鹽藻是通過在細胞內(nèi)快速而大量的合成甘油來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外的滲透平衡的。本實驗室首次從鹽藻中克隆到了甘油合成途徑上的關鍵酶基因一3-磷酸甘油脫氫酶的兩個同工酶基因GPDHl和GPDH2。為了搞清楚GPDHZ和GPDH2

2、在鹽藻細胞里的具體分工，揭示兩種同工酶特殊的基因結構與其高效甘油轉化效率之間的關系，以及這兩個新基因產(chǎn)生的分子機制與鹽藻進化之間的關系。本論文研究了GPDHl和GPDH2兩種同工酶基因在脅迫條件下的表達與甘油合成動態(tài)變化之間的關系，并對3-磷酸甘油脫氫酶同工酶基因進行生物信息分析、大腸桿菌表達、以及重組蛋白的酶活特性研究和基因組結構比較分析。取得的結果如下： 1、克隆獲得了鹽藻3-磷酸甘油脫氫酶基因GPDHl，通過對鹽藻的GPD

3、Hl和 GPDH2進行序列分析，發(fā)現(xiàn)這兩條同工酶都具有兩個結構域，即絲氨酸磷 酸化酶(SerB)結構域和3-磷酸甘油脫氫酶(GPD)結構域，相對于其它 已經(jīng)報道的植物3-磷酸甘油脫氫酶多出來一個SerB結構域。因此，我們認 為鹽藻的GPDHl和GPDH2是兩條新基因，它們的SerB結構域具有3-磷酸甘油磷酸化酶的功能，這樣GPDHl和GPDH2就能直接催化磷酸二羥丙 酮(DHAP)產(chǎn)生甘油，大大加速了甘油的合成效率。這也可以解

4、釋鹽藻能 夠快速而大量的合成甘油這一特點。 2、通過大腸桿菌表達和純化，我們驗證了具有兩個結構域的GPDH2重組蛋白可 以直接催化DHAP產(chǎn)生甘油，從而證明了新基因GPDH2的新功能就是直接催 化DHAP產(chǎn)生甘油。由于GPDHI和GPDH2結構上高度相似，所以我們猜測GPDHI 也可以直接催化DHAP產(chǎn)生甘油。 3、采用real-timc PCR和Northern雜交研究了這兩個同工酶基因的表達特性，發(fā)現(xiàn)GPDH

5、I受到鹽脅迫的誘導，而且也受到氧化脅迫和厭氧脅迫的誘導；而GPDH2受到鹽脅迫和厭氧脅迫的誘導，卻受到氧化脅迫的抑制。同時我們檢測了各種脅迫下鹽藻細胞甘油合成的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)氧化脅迫和鹽脅迫下，鹽藻細胞的甘油合成增加的速率幾乎一樣，說明在氧化脅迫下GPDH2表達的降低幾乎不影響甘油的合成效率。和釀酒酵母的GPD1和GPD2相比較，我們認為，鹽藻的GPDH1和酵母的GPD1相似，主要負責在有氧情 況下合成甘油；而鹽藻的GPDH2和酵母的

6、GPD2相似，主要負責在無氧情況下合成甘油。 4、我們認為鹽藻的新基因GPDH1和GPDH2能直接催化DHAP產(chǎn)生甘油是鹽藻能快速而大量合成甘油的關鍵所在，和耐鹽密切相關，是鹽藻生活在高鹽環(huán)境下進化的產(chǎn)物，我們通過實驗初步探討了新基因GPDH2產(chǎn)生的分子機制。用GPDH2的SerB結構域作為探針進行SotJthern雜交，D.salina和 D.bardawil都出現(xiàn)了兩條很明顯的條帶；用GPDH2的GPD結構域作為探針 進

7、行Southern雜交，D.salina和D.bardawi都只出現(xiàn)了一條清晰的條帶。 在分析GPDH2的基因組結構時，發(fā)現(xiàn)SerB結構域相對應的基因組區(qū)域存在 內(nèi)含子。所以我們認為新基因GPDH2產(chǎn)生的分子機制是“基因復制”，即位 于染色體上另一位點的親本SerB基因通過復制產(chǎn)生一個新的拷貝，這個拷 貝再插入到3-磷酸甘油脫氫酶基因的5’端，從而產(chǎn)生了現(xiàn)在這個結構奇特 的GPDH2新基因；當我們用杜氏藻的淡水藻種D.late