乙醇脫氫酶的制備工藝及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、本課題圍繞“乙醇脫氫酶(ADH)的制備工藝及酶學(xué)性質(zhì)”研究了以下內(nèi)容： 分別從廢棄啤酒酵母和實驗室培養(yǎng)的醋酸桿菌中制備ADH，考察了不同提取條件對ADH提取效果的影響，并對其中的主要影響因素進行了L9(33)正交分析。采用硫酸銨沉淀、透析、柱層析、SDS-PAGE對啤酒廢酵母ADH進行了分離純化。結(jié)果顯示，采用超聲破碎法進行酵母細胞破碎，料液比1:2、一次性處理樣品量20g、提取緩沖液pH值為8.5、超聲功率320W、超聲全程時

2、間10min，為ADH最佳提取工藝。粗酶液經(jīng)過鹽析、透析、SephadexG-75柱層析后，其純化倍數(shù)可達2.13。經(jīng)SDS-PAGE電泳后發(fā)現(xiàn)，純化前后的ADH酶液與標準品有一條共同的蛋白帶，即為分離純化后所要得到的ADH亞基的蛋白帶。 在醋酸桿菌ADH分離提取過程中，采用超聲波破碎法對細胞進行破碎，料液比1:3、超聲功率400W、超聲全程時間15min、提取緩沖液pH7.0為最佳提取工藝。粗酶液經(jīng)過鹽析、透析、Sephade

3、xG-75柱層析后，其純化倍數(shù)為1.92。通過SDS-PAGE電泳后，可以看到純化前后的ADH酶液在啤酒酵母標準品稍微偏上的位置有一條共同的蛋白帶，由此推測，醋酸桿菌中的ADH亞基分子量比啤酒酵母ADH的亞基小。 分別考察了啤酒廢酵母中ADH和醋酸桿菌中ADH的部分酶學(xué)性質(zhì)，由試驗結(jié)果得知，啤酒廢酵母ADH以NAD+為輔酶，催化乙醇反應(yīng)的最適pH為9.0，在pH8.5～pH10之間保存較為穩(wěn)定。最適反應(yīng)溫度為27℃，在低于25℃

4、保溫時ADH活力最高。各種金屬離子對其活力影響結(jié)果為：K+有促進作用，Ag+有較強的抑制作用；二價金屬離子中，Cu2+的抑制作用較明顯，而Ca2+卻有較強的促進作用。該酶有廣泛的底物專一性，乙醇是最好的底物，對甲醇和甲醛活性很小，但辛醇和烯丙醇也是ADH極好的底物。 醋酸桿菌ADH在催化乙醇發(fā)生氧化反應(yīng)時所依賴的輔酶為NAD+，pH8.0為其最適反應(yīng)pH，在pH8.0到9.5之間保存時ADH活力最高。最適反應(yīng)溫度為45℃，在30

5、℃之下保存時較為穩(wěn)定。各種金屬離子對醋酸桿菌ADH有不同的影響，K+對其有促進作用，Ag+有很強的抑制作用。二價金屬離子中，Zn2+有抑制作用，Ca2+和Cu2+的抑制作用較為明顯，而Mg2+有促進作用。Fe3+的抑制作用也較強。醋酸桿菌中ADH對直鏈含有-CH2OH基團的伯醇(如乙醇、正丙醇)結(jié)合力較強，而對于多元醇(如丙三醇)的結(jié)合力則很弱，乙醇為其最佳底物。 試驗采用酸性重鉻酸鹽氧化法檢測樣品中乙醇含量的變化。以啤酒廢酵母

6、中的ADH為試驗材料，分別在體內(nèi)和體外進行了ADH分解乙醇的試驗。ADH加入到人工胃液中，于37℃下6min左右就會失活。當人工胃液與ADH酶液的比例為1:1時，ADH失活速度就會減緩。ADH酶液在人工腸液中放置24h后，ADH活力可損失將近一半。ADH在人工腸液和人工胃液中都可引起乙醇分解，在人工腸液中其分解能力更強一些。體內(nèi)試驗以小鼠血液中乙醇含量的變化為指標，選用0.016mL/g的劑量作為小鼠酒醉乙醇的用量，通過ADH的防酒醉試