產(chǎn)氣莢膜梭菌甘油脫水酶及其激活因子基因的鑒定.pdf

1、甘油脫水酶(glyceroldehydratase,EC4.2.1.30)能催化甘油和1，2-丙二醇轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醛。近來(lái)，由于其作為由生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)1，3-丙二醇(工業(yè)上有重要用途的化工材料)的限速酶而成為研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的甘油脫水酶存在于代謝產(chǎn)物含有1，3-丙二醇細(xì)菌中，如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、弗氏檸檬菌(Citrobacterfreundii)和梭菌屬巴氏梭菌(Clostridiumpast

2、eurianum)等。不同來(lái)源甘油脫水酶在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)上都具有較高的保守性。 通過(guò)對(duì)甘油脫水酶氨基酸序列的Blast分析，我們發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)基因組序列的一個(gè)多順?lè)醋又写嬖谖鍌€(gè)開(kāi)放讀碼框，它的氨基酸序列與其它甘油脫水酶及其激活因子的氨基酸序列同源性較高。但在GenBank上這些讀碼框有些被注釋為甘油脫氫酶，有些并未進(jìn)行注釋。為鑒定這些讀碼框的功能本研究以產(chǎn)氣莢膜梭菌的總DNA為模

3、板，PCR擴(kuò)增假定的甘油脫水酶基因和甘油脫水酶的激活因子，分別構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-dhaBCE和pSE-dhaFG，并在大腸桿菌中表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果顯示重組菌pET-dhaBCE和pSE-dhaFG分別有61kD、21kD、16kD和66KD、13KD特異性蛋白條帶出現(xiàn)。利用金屬鎳親和層析及S-300H凝膠層析將重組蛋白進(jìn)行分離純化，得純蛋白dhaBCE和dhaFG。重組蛋白dhaBCE具有甘油脫水酶活性，以甘油和1，2-

4、丙二醇作底物，比活分別為131U/mg和87U/mg。此甘油脫水酶的最適反應(yīng)溫度約為42℃，最適作用pH約為9.2，其對(duì)甘油、1，2-丙二醇和乙二醇的Km值分別是0.30mM、0.48mM和3.90mM，對(duì)酶催化活性必需的輔酶B12的Km值為8.2nM。重組蛋白dhaFG能夠把經(jīng)氧完全失活的甘油脫水酶重新激活，并能維持甘油脫水酶在以甘油為底物進(jìn)行催化時(shí)的活性。 本研究對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的甘油脫水酶及其激活因子進(jìn)行了初步鑒定。這為了解